■賴(lài)根生 李 潔 劉子睦 薛鮮麗，3 王德培，3*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津 300457；3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又名嘔吐毒素，是由鐮刀菌屬所產(chǎn)生的一種單端孢霉烯族毒素[1]。在禾本科作物生長(zhǎng)過(guò)程中極易感染的鐮刀菌屬病害導(dǎo)致采收后各主要糧食籽粒被毒素污染，同時(shí)，在飼料的加工和儲(chǔ)存中極易由于霉變而產(chǎn)生各種霉菌毒素，其中以DON污染最為廣泛[2]。嘔吐毒素是飼料及飼料原料中污染最普遍的霉菌毒素。有報(bào)道2019 年嘔吐毒素在飼料及原料樣品中檢出率高達(dá)93.22%，超標(biāo)率27.42%，在檢測(cè)的毒素中最為突出，并且相比2018 年檢測(cè)結(jié)果，嘔吐毒素污染更為嚴(yán)重[3]。DON 具有較強(qiáng)的耐熱和耐酸能力，在pH 10.0，170 ℃加熱15 min 才能完全被破壞[4]，因此在以糧食作物為原料的食物和飼料的加工過(guò)程中，DON基本不被破壞或降解，故廣泛在食物鏈中流通[5]。DON 具有較強(qiáng)的毒性，豬攝入0.1～0.2 mg/kg 的DON 就會(huì)引起嘔吐，進(jìn)而引起食欲下降、生長(zhǎng)遲緩、抵抗力下降等，若長(zhǎng)期給動(dòng)物喂食含有DON 的飼料，更是會(huì)給養(yǎng)殖業(yè)特別是養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失[6-7]。若人體長(zhǎng)期食用含DON的糧食作物或被DON污染飼料所飼養(yǎng)的動(dòng)物及其畜產(chǎn)品，也會(huì)造成如免疫力下降、軟骨組織壞死等極大的危害[8]。

DON的脫除方法有物理法、化學(xué)法和生物法。物理法去除DON 會(huì)造成糧食營(yíng)養(yǎng)流失，同時(shí)可能產(chǎn)生新的有害物質(zhì)，且成本大；化學(xué)法去除DON，污染大，可能增加新的未知物質(zhì)；生物處理過(guò)程溫和且利于大規(guī)模使用，特別是微生物法脫除DON 是目前最經(jīng)濟(jì)有效的方法[9-11]。因此，篩選出能夠高效且安全降解DON的微生物菌株是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[12]。

在國(guó)內(nèi)外已有大量有關(guān)微生物脫除DON 的研究。從20世紀(jì)70年代起，有研究表明DON最主要的毒性位點(diǎn)是C12、C13的環(huán)氧結(jié)構(gòu)，其可能作用的機(jī)理是抑制細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成[13]。之后陸續(xù)有報(bào)道微生物可通過(guò)分解環(huán)氧結(jié)構(gòu)降解DON。Yoshizawa 等[14]報(bào)道，動(dòng)物腸道中的細(xì)菌可以分解單端孢霉烯中的環(huán)氧結(jié)構(gòu)，DON 的降解產(chǎn)物為C12 和C13 形成雙鍵的物質(zhì)。Fuchs等[15]采用氣質(zhì)聯(lián)用（GC/MS）和顆粒束界面-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-PB-MS）方法，確定了BBSH797菌株降解DON 的代謝產(chǎn)物為DOM-1。He 等[16]發(fā)現(xiàn)，雞腸道中微生物在96 h內(nèi)可轉(zhuǎn)化98%以上的DON標(biāo)品，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鑒定為DOM-1，可將DON的環(huán)氧環(huán)打開(kāi)，產(chǎn)物毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于DON。Eriksen 等[17]通過(guò)毒性試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DOM-1的毒性為DON的1/55。Li等[18]研究表明芽孢桿菌LS100 可將嘔吐毒素轉(zhuǎn)化成DOM-1，并通過(guò)仔豬飼喂試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)物DOM-1不會(huì)對(duì)豬產(chǎn)生負(fù)面影響。另一方面，乳酸菌對(duì)DON等真菌毒素具有吸附作用，對(duì)降低DON含量、減少對(duì)動(dòng)物損傷有一定的作用。胡杉杉等[19]分離出一株副干酪乳桿菌，對(duì)DON去除率達(dá)40.4%，且對(duì)DON有耐受能力。El-Nezami等[20]研究了鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGG）對(duì)DON的去除作用，發(fā)現(xiàn)活菌和滅活的菌株在去除DON能力上沒(méi)有顯著差異，且未發(fā)現(xiàn)新物質(zhì)生成，表明Lactobacillus rhamnosusGG通過(guò)吸附作用去除DON。

本文旨在篩選和鑒定出能夠高效、安全降解和去除DON的微生物，同時(shí)嘗試將其應(yīng)用在飼料發(fā)酵中，以期能夠在獲得優(yōu)良的發(fā)酵飼料的同時(shí)使其DON含量和對(duì)畜禽的毒性降低，一方面發(fā)掘利用新的微生物資源，為我國(guó)發(fā)酵飼料的發(fā)展奠定基礎(chǔ)，另一方面為微生物降解霉菌毒素的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

玉米胚芽粕、玉米小雜、噴漿玉米皮（黑龍江金象生化有限責(zé)任公司），實(shí)驗(yàn)室保藏的野生芽孢菌54株和乳酸菌12株。

1.1.2 主要試劑

苯基環(huán)氧乙烷（上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司）；DON標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司）；嘔吐毒素酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)試劑盒AgraQuant COKAQ4000（美國(guó)ROMER公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB 固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，pH 7.0～7.4。

LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 L，pH 7.0～7.4。

初篩培養(yǎng)基：（NH4）2SO41 g、KH2PO43 g、K2HPO46 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl20.05 g、FeSO4·7H2O 0.001 g、蛋白胨0.05 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，pH 6.0～7.0。滅菌后加入過(guò)濾除菌的苯基環(huán)氧乙烷，終濃度為15 mmol/L。

復(fù)篩培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、DON 1 mg、蒸餾水1 L，pH 7.0～7.4。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸三銨2 g、吐溫80 1 g、K2HPO42 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、CaCO35 g、蒸餾水1 L、瓊脂18 g，pH 6.2～6.6，115 ℃高壓滅菌15 min。

飼料發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米胚芽粕17 g、玉米小雜17 g、玉米皮17 g、水40 mL，pH 6.0。無(wú)需滅菌。

以上培養(yǎng)基除特殊說(shuō)明外均需121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.4 儀器與設(shè)備

光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS 公司）；高壓蒸汽滅菌鍋LDZX-50FB（上海申安醫(yī)療器械廠）；生化培養(yǎng)箱LRH-250-A（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（天津市天宇機(jī)電有限公司）；PCR 儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；酶標(biāo)儀Infinite 200PRO（奧地利TECAN公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（天津市華偉科技有限公司）；物傳感分析儀SBA-40E（山東省科學(xué)院生物研究所）。

1.2 DON降解菌的篩選與鑒定

1.2.1 DON降解菌株的初篩

將實(shí)驗(yàn)室保藏的54 株芽孢菌在LB 平板上劃線活化，37 ℃培養(yǎng)12 h，再挑取單菌落分別劃線到初篩培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)3 d，挑選出生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行下一步篩選。

1.2.2 DON降解菌株的復(fù)篩

取初篩菌株中生長(zhǎng)良好的菌株接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)12 h。按2%的接種量將菌液接種到50 mL 液體復(fù)篩培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)16 h。以未接菌的復(fù)篩培養(yǎng)基為對(duì)照。取培養(yǎng)液1 mL，以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，通過(guò)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，稀釋一定的倍數(shù)后使用ELISA試劑盒檢測(cè)DON殘余量，計(jì)算菌株對(duì)DON的降解率。選取DON降解率高的菌株并保藏試管斜面。

1.2.3 菌株鑒定

將篩選菌株單菌落劃線于LB 培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，并挑取部分單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

將篩選菌株單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h，取菌液稀釋并置于PCR 儀中98 ℃裂解10 min，以裂解菌液做模板，以通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）對(duì)菌株16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系：模板1 μL，上游引物27F和下游引物1492R各1 μL，DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s并循環(huán)30次，72 ℃再延伸10 min。

以通用引物UP1（5’-GAAGTCATCATGACCGTT CTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’）和UP2r（5’-CA GGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNG-3’）對(duì)菌株gyrB基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 體系：模板1 μL，上游引物UP1和下游引物UP2r各1 μL，DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、61 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s并循環(huán)35次，72 ℃再延伸10 min。

PCR產(chǎn)物取2 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，將產(chǎn)物送往GENEWIZ 進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取同源性高的16S rDNA 基因和gyrB基因序列，分別通過(guò)MEGA 7以鄰接法（Neighbour-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 脫除DON的乳酸菌篩選

將實(shí)驗(yàn)室保藏的12株產(chǎn)酸乳酸菌從斜面保藏試管接到MRS培養(yǎng)基平板，42 ℃厭氧培養(yǎng)1 d，挑取單菌落接種到含有1 μg/mL DON的MRS液體培養(yǎng)基中，42 ℃靜置培養(yǎng)48 h，以不接菌的含1 μg/mL DON 的MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照，分別取1 mL培養(yǎng)液8 000 r/min離心10 min，取上清液并通過(guò)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，稀釋一定的倍數(shù)，使用ELISA 試劑盒檢測(cè)DON 殘留量，計(jì)算DON脫除率。

1.3 DON降解菌生長(zhǎng)曲線

將篩選的DON 降解菌BL-14從斜面保藏試管接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h作為BL-14 種子液，以2%的接種量將種子液分別接種到添加有1 μg/mL DON的LB液體培養(yǎng)基和無(wú)DON的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h以上，分別在固定的時(shí)間點(diǎn)取樣并測(cè)量培養(yǎng)液的OD600值。

1.4 發(fā)酵飼料應(yīng)用

將篩選出的一株DON降解芽孢菌和兩株DON脫除乳酸菌分別從斜面保藏試管接到LB或MRS培養(yǎng)基平板上，芽孢菌以37 ℃培養(yǎng)12 h，乳酸菌以42 ℃培養(yǎng)24 h。再挑取單菌落分別接到LB或MRS液體培養(yǎng)基中，芽孢菌以37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h，乳酸菌以42 ℃靜置培養(yǎng)24 h。將一株芽孢菌和兩株乳酸菌的種子液以3∶1∶1 的比例，以總接種量6%接種到預(yù)先混合好的飼料原料中，混勻后裝入螺口瓶中壓實(shí)并密封，室溫放置7 d，同時(shí)設(shè)置不接菌的飼料發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照。

發(fā)酵結(jié)束后，取10 g 發(fā)酵飼料研磨粉碎，倒入90 mL無(wú)菌蒸餾水中，180 r/min振蕩2 h，取1 mL混合液8 000 r/min離心10 min，吸取上清液并稀釋一定的倍數(shù)，用磷酸氫二鉀調(diào)節(jié)pH 到6～8，用ELISA 試劑盒檢測(cè)DON含量，計(jì)算DON脫除率，同時(shí)使用生物傳感分析儀檢測(cè)乳酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 DON降解菌的初篩

DON 分子中的C12、C13 環(huán)氧基團(tuán)是其最主要的毒性基團(tuán)，故使用具有相似的環(huán)氧結(jié)構(gòu)的苯基環(huán)氧乙烷做唯一碳源，篩選出能夠破壞環(huán)氧結(jié)構(gòu)以利用苯基環(huán)氧乙烷的菌株，初步篩選出可能的DON 降解菌株[21]。對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的54株芽孢菌進(jìn)行初篩，篩選出10 株潛在可能的DON 降解菌BL-1、BL-2、BL-4、BL-8、BL-12、BL-14、BL-d、BL-e、BL-r、BL-x。

2.2 DON降解菌的復(fù)篩

通過(guò)在培養(yǎng)基中添加一定量的DON 進(jìn)行發(fā)酵，使用DON檢測(cè)酶聯(lián)免疫試劑盒直接檢測(cè)發(fā)酵16 h后發(fā)酵液中DON 的殘留量以進(jìn)一步篩選出DON 降解菌。從10株潛在的DON降解菌中篩選出3株DON降解率較高的芽孢菌BL-12、BL-14、BL-d，其中BL-14菌株的DON降解率最高，在含有1 μg/mL DON的LB培養(yǎng)基中發(fā)酵16 h的DON降解率可達(dá)82.63%（見(jiàn)表1）。

2.3 BL-14菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)

BL-14 菌株在LB 培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)，呈月白色圓形菌落，不透明，表面凸起有褶皺、中心有放射狀褶皺，易挑起，與培養(yǎng)基結(jié)合不緊密，用接種針挑取菌落有黏稠感且濕潤(rùn)（見(jiàn)圖1）。在光學(xué)顯微鏡下染色觀察BL-14 菌株細(xì)胞形態(tài)為短桿狀革蘭氏陽(yáng)性菌，有部分細(xì)胞中有橢圓形透明未染色部分，判斷為芽孢（見(jiàn)圖2），初步推斷該菌為芽孢桿菌屬。

圖1 菌株BL-14的菌落形態(tài)

圖2 菌株BL-14的細(xì)胞形態(tài)

2.3.2 分子鑒定

BL-14 菌株的16S rDNA 序列與貝萊斯芽孢桿菌（Bacilus velezensis）有99.43%的相似度，初步確定BL-14為Bacilus velezensis，將部分不同種的芽孢桿菌屬模式菌株的16S rDNA與BL-14的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖3）。通過(guò)比較gyrB基因序列在區(qū)分和鑒定細(xì)菌近緣種方面比16S rDNA具有更高的分辨率[22]，BL-14 的gyrB基因序列驗(yàn)證鑒定結(jié)果，與Bacilus velezensis有99.66%的相似度，與16S rDNA 鑒定結(jié)果相符。以BL-14的gyrB基因序列與其在NCBI上比對(duì)的同源性相似的部分已知序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖4）。

圖3 基于16S rDNA序列菌株BL-14的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖4 基于gyrB基因序列菌株BL-14的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 乳酸菌脫除DON

從實(shí)驗(yàn)室保藏的12株產(chǎn)乳酸能力強(qiáng)的乳酸菌中篩選出2 株DON 脫除率較高的乳酸菌NJ8 和RS1，發(fā)酵48 h 對(duì)DON 的脫除率分別達(dá)28.50%和30.29%（見(jiàn)表2）。

表2 12株乳酸菌對(duì)DON的脫除率

2.5 DON降解菌生長(zhǎng)曲線及其對(duì)DON耐受性

以生長(zhǎng)時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，菌體濃度OD600值為縱坐標(biāo)，繪制菌株BL-14在不添加DON和添加1 μg/mL DON 時(shí)的生長(zhǎng)曲線（見(jiàn)圖5）。在添加1 μg/mL DON的環(huán)境下，菌株BL-14在2 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在10 h左右結(jié)束對(duì)數(shù)生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，22 h左右開(kāi)始衰亡。相比不添加DON 的情況，添加DON 時(shí)菌株BL-14對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間和生長(zhǎng)速率沒(méi)有明顯變化，穩(wěn)定期時(shí)的菌濃度峰值略有降低，且穩(wěn)定期明顯縮短，菌株提前進(jìn)入衰亡期，衰亡趨勢(shì)顯著?？傮w來(lái)說(shuō)，BL-14在快速生長(zhǎng)階段對(duì)DON有較好的耐受能力，但是可能會(huì)因DON影響，難以維持穩(wěn)定生長(zhǎng)而提前衰亡。

圖5 菌株BL-14的生長(zhǎng)曲線

2.6 發(fā)酵飼料應(yīng)用

將篩選出適用于飼料發(fā)酵的產(chǎn)酶豐富、且降解DON 能力較強(qiáng)的芽孢桿菌BL-14 和產(chǎn)乳酸多且有DON脫除能力的乳酸菌NJ8和RS1三株菌以3∶1∶1的比例（芽孢菌∶乳酸菌=3∶2）接種到飼料原料中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)其DON 的降解率（見(jiàn)表3）。結(jié)果顯示以篩選出的DON 降解菌BL-14 與乳酸菌NJ8、RS1 協(xié)同發(fā)酵飼料，可將飼料中的DON 含量從3.81 mg/kg降到1.39 mg/kg，降解率最高可達(dá)63.52%。同時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后乳酸菌數(shù)目可達(dá)109個(gè)/g，并產(chǎn)生約35 g/L的乳酸。另外，從表3中可以看到，DON降解率與發(fā)酵后芽孢菌的數(shù)目呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，可以初步判斷在此次發(fā)酵中，芽孢菌BL-14起到主要的DON降解作用。

表3 發(fā)酵飼料應(yīng)用試驗(yàn)效果檢測(cè)

3 討論

飼料及飼料原料中的DON可通過(guò)食物鏈廣泛地?cái)U(kuò)散，極大地危害畜禽和人類(lèi)[23]。微生物降解DON具有過(guò)程溫和、對(duì)環(huán)境污染小、成本低等優(yōu)點(diǎn)。另外，在飼料發(fā)酵過(guò)程中部分微生物的代謝可以降低飼料中毒素的含量，使得發(fā)酵飼料中的有害物質(zhì)含量比未發(fā)酵飼料更低[24]。本研究篩選出的菌株BL-14 經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacilus velezensis），是一種新型的生防微生物菌種，屬于好氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、繁殖快、抗逆性強(qiáng)，具有豐富的產(chǎn)酶體系，能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)抑制腸道致病菌的生長(zhǎng)繁殖，對(duì)多種動(dòng)物疾病有防治作用，在發(fā)酵飼料中有很大的應(yīng)用潛力[25-26]。另外，已有研究報(bào)道，貝萊斯芽孢桿菌可降解飼料中的常見(jiàn)毒素如玉米赤霉烯酮（ZEN）和黃曲霉毒素B1（AFB1）等。王楠[27]從土壤中篩選出一株Bacilus velezensisA2，可在24 h內(nèi)將飼料中污染的ZEN（60 mg/kg）完全降解。王明清等[28]以香豆素為唯一碳源從土壤中篩選出一株Bacilus velezensisA6，該菌在37 ℃孵育72 h 可將AFB1 降解90.6%。這些研究表明，貝萊斯芽孢桿菌在降解真菌毒素方面有很大的潛力。除貝萊斯芽孢桿菌外的其他芽孢桿菌屬細(xì)菌也是如此。徐海軍等[29]從母豬糞便中篩選到一株對(duì)飼料中污染的嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1 均有較好的降解作用的芽孢桿菌ODS-1，對(duì)三種霉菌毒素降解率均達(dá)到70%以上。杜穩(wěn)等[30]將一株可高效降解DON的枯草芽孢桿菌ASAG-35的發(fā)酵工藝優(yōu)化并制成菌劑投入糧食加工副產(chǎn)物中，最高可脫除糧食副產(chǎn)物中90%以上的DON。梁含等[31]篩選出一株枯草芽孢桿菌LB01 和一株解淀粉芽孢桿菌NA06，其中LB01 對(duì)麩皮中嘔吐毒素降解率達(dá)71%，NA06對(duì)豆粕中嘔吐毒素降解率高達(dá)82%。

本研究篩選出的貝萊斯芽孢桿菌BL-14 不僅可高效降解DON，而且菌株安全無(wú)毒且可產(chǎn)豐富的各類(lèi)水解酶，能夠高效降解飼料中的DON 同時(shí)能夠產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶，能夠?qū)暳显现械纳锎蠓肿臃纸鉃橐子谛笄菹盏臓I(yíng)養(yǎng)小分子物質(zhì)。菌株BL-14非常適用于飼料添加劑應(yīng)用在飼料發(fā)酵中。將菌株BL-14和兩株乳酸菌NJ8、RS1結(jié)合協(xié)同發(fā)酵飼料，可在較短時(shí)間內(nèi)高效降低飼料原料中超標(biāo)的DON含量，同時(shí)可以增加飼料的營(yíng)養(yǎng)成分，產(chǎn)生較多的乳酸，改善飼料的風(fēng)味，增加適口性，提高了飼料利用率，并且可以降低動(dòng)物生產(chǎn)成本，預(yù)防DON對(duì)動(dòng)物的損害，對(duì)飼料和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)有較大的應(yīng)用潛力。

對(duì)于菌株BL-14降解DON 的機(jī)制也做了部分研究，利用高效液相色譜技術(shù)（HPLC）檢測(cè)菌株降解DON的效率和DON降解產(chǎn)物，觀察色譜圖發(fā)現(xiàn)，對(duì)于含1 μg/mL DON 的液體培養(yǎng)基，接種了BL-14 培養(yǎng)16 h以后，DON對(duì)應(yīng)的色譜峰峰面積下降了68.75%，但是還未從色譜圖中發(fā)現(xiàn)新的產(chǎn)物峰出現(xiàn)，后續(xù)可能會(huì)嘗試調(diào)整HPLC檢測(cè)條件和采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）以期尋找到菌株BL-14 降解DON 的降解產(chǎn)物。同時(shí)，在基因?qū)用嬉矊?duì)菌株BL-14 降解DON的機(jī)制進(jìn)行研究。根據(jù)已報(bào)道的有關(guān)于DON降解菌的DON降解酶基因的文獻(xiàn)，目前已發(fā)現(xiàn)的DON降解酶基因主要有來(lái)自Devosia mutans17-2-E-8 的Dep A和Dep B基因，來(lái)自SphingomonasS3-4 的醛酮還原酶AKR18A1和來(lái)自Devosiasp. D6-9的DON脫氫酶QDDH、醛酮還原酶AKR13B2 和AKR6D1[32-35]。將這些酶的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中與貝萊斯芽孢桿菌進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)存在與酶AKR13B2 相似度最高33.44%的醛酮還原酶基因，以此設(shè)計(jì)引物，從菌株BL-14基因組中克隆出該醛酮還原酶基因并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，卻未發(fā)現(xiàn)有DON降解活性。表明菌株BL-14降解DON可能存在其他酶降解途徑。因此，對(duì)于菌株BL-14降解DON的途徑還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究以苯基環(huán)氧乙烷為唯一碳源，篩選出10株可能具有DON降解能力的芽孢桿菌，通過(guò)復(fù)篩篩選出一株DON降解菌BL-14。菌株BL-14在含有1 μg/mL DON 的LB液體培養(yǎng)基中，16 h內(nèi)DON 降解率可達(dá)到82.63%。通過(guò)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定BL-14為貝萊斯芽孢桿菌（Bacilus velezensis）。又篩選出2株可脫除DON 的乳酸菌NJ8、RS1，DON 脫除率分別為28.50%和30.29%。將篩選出的芽孢桿菌BL-14 與乳酸菌NJ8、RS1協(xié)同發(fā)酵飼料原料7 d，產(chǎn)生乳酸約35 g/L，在將飼料原料發(fā)酵成營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好的優(yōu)良飼料的同時(shí)，將飼料原料中的DON 含量從3.81 mg/kg 降到1.39 mg/kg，發(fā)酵飼料中DON脫除率達(dá)63.25%。