魏新偉，張曉剛，楊梁

（河南省安陽(yáng)市人民醫(yī)院 心內(nèi)一科，河南 安陽(yáng) 455000）

急性心肌梗死是當(dāng)今世界上最常見(jiàn)的死亡原因之一，由于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSc）的出現(xiàn)為干細(xì)胞移植治療缺血性心肌病研究注入了活力。但是iPSc 移植治療心肌受損也是一把雙刃劍，移植后會(huì)不會(huì)發(fā)生畸胎瘤；其移植后對(duì)心肌組織急性缺血損傷有何影響？ST-T 改變是典型急性心肌梗死的基本心電圖變化，并與其病理過(guò)程息息相關(guān)；前壁急性心肌梗死（AMI）心肌缺血、損傷、壞死的病理過(guò)程與ST-T 演變亦相對(duì)應(yīng)。因此，以基本電生理指標(biāo)ST-T 改變作為本實(shí)驗(yàn)的切入點(diǎn)研究iPSc 移植后對(duì)前壁AMI 心肌缺血損傷的影響具有準(zhǔn)確、便捷、易測(cè)量等優(yōu)點(diǎn)，穩(wěn)定性和重復(fù)性亦很好，所以采用ST-T 改變的檢測(cè)對(duì)AMI 心肌損傷進(jìn)行研究值得進(jìn)一步探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取自由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供癌癥研究機(jī)構(gòu)（Institute of Cancer Research,ICR）品系小鼠：雄性，體重25～30 g，8～12 周，共80 只，于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所北京干細(xì)胞庫(kù)提供實(shí)驗(yàn)中使用小鼠iPSc 細(xì)胞系。

1.2 主要試劑、儀器及iPSc 細(xì)胞鑒定、移植前準(zhǔn)備

1.2.1 主要試劑 ①培養(yǎng)基采用10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清培養(yǎng)液、緩沖液應(yīng)用磷酸緩沖液（PBS）液。②免疫組化法采用一抗為：兔抗縫隙連接蛋白43，容量0.2 mL；依次采用二抗為：生物素化羊抗兔免疫球蛋白G（IgG），容量6 mL。

1.2.2 主要儀器 ①體式鏡：XTL-3A 重慶光學(xué)儀器有限公司。②電生理儀器：BL-420F 多導(dǎo)電生理儀及生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，產(chǎn)自成都泰盟科技有限公司。③細(xì)胞移植工具：微量進(jìn)樣器，容量50 μL，產(chǎn)自寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠。

1.2.3 iPSc 細(xì)胞鑒定 首先形態(tài)學(xué)觀察，其次功能學(xué)上用堿性磷酸酶染色進(jìn)行最后移植前鑒定。

1.2.4 iPSc 細(xì)胞移植前的準(zhǔn)備 首先采用SD 胎鼠成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層的方法對(duì)iPSc 培養(yǎng)，其移植前應(yīng)用顯微鏡下計(jì)數(shù)方法備用。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 ①正常對(duì)照組（NCG）的設(shè)置：在造小鼠動(dòng)物模型前按照數(shù)字隨機(jī)化方法取20 只正常ICR 小鼠依次編號(hào)順序?yàn)?～20，設(shè)為正常對(duì)照組，于移植后5 min、1 周、2 周、3 周各時(shí)間點(diǎn)取5 只小鼠用于對(duì)照；②其他實(shí)驗(yàn)組設(shè)置：將造模成功的實(shí)驗(yàn)小鼠按1～45 編號(hào)，用完全隨機(jī)法分為假手術(shù)對(duì)照急性心肌梗死+生理鹽水（AMI+NS）組、急性心肌梗死+移植iPS 細(xì)胞（AMI+iPSc）組及急性心肌梗死+移植成纖維細(xì)胞（AMI+Fb）組，每組15 只小鼠。經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的標(biāo)準(zhǔn)［1］。

1.3.2 iPSc 移植方法 于小鼠左前降支結(jié)扎后30 min內(nèi)采用微量注射器吸取濃度為2×1012/L iPSc 懸液10 μL，分別以其前壁肉眼可見(jiàn)輕微紫紅色壞死區(qū)中心為圓點(diǎn)按12 點(diǎn)、3 點(diǎn)、6 點(diǎn)、9 點(diǎn)鐘方向選擇4 個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)用量2.5 μL 小心緩慢注射入心肌肌層。假手術(shù)對(duì)照組生理鹽水的注射方法及作為比較的Fb 細(xì)胞移植方法均效仿iPSc 進(jìn)行移植。

1.3.3 造模方法 ①造模的重要步驟：結(jié)扎小鼠左冠前降支方法采用8～0 絲線穿過(guò)前降支近端以及其下方少量肌束。②造模成功后標(biāo)準(zhǔn)：形態(tài)學(xué)上可見(jiàn)小鼠前降支對(duì)應(yīng)供血區(qū)域前壁心肌由紅潤(rùn)變?yōu)樽霞t色，略顯一點(diǎn)蒼白。體表心電圖基本指標(biāo)肢體導(dǎo)聯(lián)Ⅰ、加壓肢體導(dǎo)聯(lián)（AVL）的ST 段抬高大于0.1 mV。③術(shù)后處理：手術(shù)后即刻及術(shù)后3 d，肌肉注射青霉素注射液8 萬(wàn)IU/d 預(yù)防感染。

1.3.4 心臟組織學(xué)標(biāo)本采集 模型建立后1 周、2周、3 周時(shí)用10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉動(dòng)物，仰臥位將小鼠固定，氣管插管，開(kāi)胸暴露心臟。沿結(jié)扎縫合線層面以下剪取厚約3 mm 組織，用生理鹽水沖洗干凈，放置于4%的多聚甲醛溶液固定。制作石蠟切片，用于伊紅（HE）染色。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 標(biāo)本取材 心臟組織學(xué)標(biāo)本采樣于動(dòng)物模型成功建立后1 周、2 周、3 周各個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)采集心肌標(biāo)本。

1.4.2 各組小鼠心電圖ST-T 改變記錄、測(cè)量和分析 采用BL-420 生物機(jī)能系統(tǒng)多導(dǎo)電生理儀分階段按時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)體表心電圖I、AVL 肢體導(dǎo)聯(lián)ST-T 演變的變化。

1.4.3 酶免疫組化法檢測(cè)小鼠心肌組織縫隙連接蛋白（Cx43）的表達(dá) AMI+NS 組、AMI+iPSc 組、AMI+Fb組等各組小鼠分別于模型建立后即刻、iPSc及Fb 移植后1 周、2 周、3 周各個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行心電圖ST-T 改變檢測(cè)后迅速開(kāi)胸切取心臟梗死區(qū)心肌組織，采用免疫組化Image-Pro Plus 圖像數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對(duì)比分析并計(jì)算出平均光密度值（mean density）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0 軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)采集數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，iPSc 移植后各小組ST-T 改變指標(biāo)應(yīng)用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組間比較分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模前后心電圖、iPSc 及成纖維細(xì)胞（Fb）移植前后ST-T 比較

造模前正常對(duì)照組及假手術(shù)對(duì)照（AMI+NS）組小鼠造模后特征心電圖改變，見(jiàn)圖1、圖2。假手術(shù)對(duì)照組小鼠造模后即刻的ST 段壓低及T 波倒置與NCG 組小鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。iPSc 移植后梗死小鼠ST-T 變化的對(duì)比，iPSc 組于移植后2 周ST 壓低、T 波倒置分別與假手術(shù)對(duì)照組心梗造模后即刻ST 壓低、T 波倒置比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與iPSc 移植后2 周ST 段壓低及T 波倒置指標(biāo)改善效果相比較，AMI+Fb 組則無(wú)此效果。iPSc 及Fb 移植后對(duì)急性前壁心肌梗死小鼠ST-T 演變比較，見(jiàn)表1。

圖1 造模前正常對(duì)照組小鼠心電圖

圖2 假手術(shù)對(duì)照組造模后小鼠特征心電圖改變

表1 iPSc 及Fb 移植后對(duì)急性前壁心肌梗死小鼠ST-T 演變比較（±s,mV）

表1 iPSc 及Fb 移植后對(duì)急性前壁心肌梗死小鼠ST-T 演變比較（±s,mV）

注：?與移植前比較，P＜0.05。

2.2 iPSc 移植前后對(duì)ST-T 變化的影響

iPSc 移植前（造模后）即刻即開(kāi)始了急性前壁心肌梗死小鼠缺血壞死的病理過(guò)程。ST-T 動(dòng)態(tài)改變是反映心肌缺血的重要指標(biāo)。通過(guò)對(duì)iPSc 及Fb 移植后2 周ST 段壓低及T 波倒置的檢測(cè)、對(duì)比發(fā)現(xiàn)，iPSc 移植后2 周對(duì)急性前壁心肌梗死小鼠缺血狀況有所改善。iPSc 移植后與移植前（造模后）即刻及假手術(shù)對(duì)照組小鼠的ST 段壓低及T波倒置的演變比較，見(jiàn)表2。

表2 iPSc 細(xì)胞移植前后AMI 小鼠ST-T 演變一覽表（±s,mV）

表2 iPSc 細(xì)胞移植前后AMI 小鼠ST-T 演變一覽表（±s,mV）

注：?表示與移植前比較，P＜0.05。

2.3 iPSc 移植后及Fb 移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ST-T變化比較

iPSc 移植后2 周ST 壓低、T 波倒置分別與移植前（造模后）即刻ST 壓低、T 波倒置及假手術(shù)對(duì)照組2 周ST 壓低、T 波倒置相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。而Fb 移植后1 周及3 周分別與前者及后者相同時(shí)間點(diǎn)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表3 iPSc 細(xì)胞移植后與假手術(shù)對(duì)照組的指標(biāo)變化比較（n=20,±s,mV）

表3 iPSc 細(xì)胞移植后與假手術(shù)對(duì)照組的指標(biāo)變化比較（n=20,±s,mV）

注：?iPSc 移植后2 周與假手術(shù)對(duì)照組比較，P＜0.05。

表4 Fb 細(xì)胞移植后與假手術(shù)對(duì)照組的指標(biāo)變化比較（n=20,±s,mV）

表4 Fb 細(xì)胞移植后與假手術(shù)對(duì)照組的指標(biāo)變化比較（n=20,±s,mV）

2.4 iPSc 移植后及Fb 移植后Cx43 的表達(dá)

iPSc 移植后梗死小鼠心肌Cx43 的表達(dá)iPSc 組及假手術(shù)對(duì)照組比較，前者的測(cè)定值高于后者的測(cè)定值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與此同時(shí)AMI+Fb 組Cx43 的表達(dá)與假手術(shù)對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 AMI+iPSc 組小鼠移植后2 周發(fā)生的ST-T 改變

3 討論

急性心肌梗死是由于冠脈血流急劇減少或中斷進(jìn)而部分心肌發(fā)生急性壞死。干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病研究一直是該領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注的研究熱點(diǎn)問(wèn)題。日本科學(xué)家YAMANAKA 于2006年成功誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（iPSc）引發(fā)了新的研究熱潮［2］。隨即iPSc 在移植治療急性心肌梗死方面的研究引爆了能量。然而該研究亦是一把雙刃劍，具有兩面性，如：移植后會(huì)不會(huì)發(fā)生室壁瘤？其次是移植后對(duì)急性心肌梗死小鼠缺血損傷有無(wú)改善？ST-T 改變是反應(yīng)急性心肌梗死（AMI）心肌急性缺血損傷特征性心電圖演變。采用ST-T 改變作為觀察指標(biāo)，研究iPSc 移植對(duì)急性前壁AMI 小鼠急性心肌缺血損傷的影響為解答這些問(wèn)題提供了強(qiáng)有力的依據(jù)。

作為外源性物質(zhì)的iPSc 移植首先遭到質(zhì)疑是能否導(dǎo)致宿主發(fā)生畸胎瘤。新近研究由人類(lèi)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞分化出的神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞在移植治療脊髓損傷的致腫瘤作用可被單純皰疹病毒胸苷激酶防止形成［3］。人類(lèi)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞及間充質(zhì)細(xì)胞在急性心肌梗死中作用比較中均未發(fā)現(xiàn)致畸胎瘤現(xiàn)象進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。其次就是其移植后所形成的干細(xì)胞異化細(xì)胞電生理學(xué)不穩(wěn)定，具有混雜性［4］。但iPSc 移植后可明顯改善心肌急性缺血損傷基本指標(biāo)ST 段壓低、T 波倒置，其原因分析如下。

心電圖ST-T 改變主要反映的是心肌細(xì)胞的復(fù)極過(guò)程，Cx43 是構(gòu)成心臟電生理結(jié)構(gòu)縫隙連接的主要組成部分，其主要反映心肌細(xì)胞活化的電耦聯(lián)活動(dòng)。AMI 時(shí)心肌細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，進(jìn)而Cx43 表達(dá)異常，對(duì)心肌細(xì)胞的電活性及其復(fù)極化過(guò)程產(chǎn)生嚴(yán)重影響，最終引起心臟電重構(gòu)。首先分析iPSc 移植后對(duì)受損心臟心肌重構(gòu)影響：從受損心肌整體上看，有研究發(fā)現(xiàn)iPSc 移植后從形態(tài)學(xué)觀察上心肌受損部位再生組織，進(jìn)而阻止受損心肌功能損傷進(jìn)程，恢復(fù)缺血心臟功能［5］。而Fb細(xì)胞移植后則無(wú)此功效。再者從受損心肌重構(gòu)微觀上分析：分別從iPSc 移植的有效性、定向性、融合性各方面分別來(lái)闡述：iPSc 移植的有效性是首先關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。新生小鼠大腦移植了來(lái)源于人iPSc 的小膠質(zhì)細(xì)胞后會(huì)分化呈現(xiàn)出初級(jí)小膠質(zhì)樣狀態(tài)，對(duì)其移植的有效性給予了很好的證明［6］。在心肌微循環(huán)中利用iPSc 發(fā)揮作用的小血管角度設(shè)計(jì)小鼠心肌薄片分化為心肌細(xì)胞并對(duì)AMI 小鼠心肌組織產(chǎn)生功能影響，提高心肌梗死邊緣帶微血管密度，穩(wěn)定梗死面積［7］。以上兩項(xiàng)研究充分證明iPSc 來(lái)源的細(xì)胞移植后不僅有效，而且可以改善受損心肌細(xì)胞的功能。iPSc 移植的定向性研究是熱點(diǎn)問(wèn)題，更是難點(diǎn)問(wèn)題。各個(gè)領(lǐng)域均有發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)自人類(lèi)iPSc 細(xì)胞不是向臆想中的腎上腺細(xì)胞分化，反而分化為分泌雄激素的間質(zhì)細(xì)胞，成為印證iPSc 分化定向性的研究亮點(diǎn)［8］；取自于人類(lèi)iPSc 分化的耳源上皮祖細(xì)胞移植可使老鼠的聽(tīng)覺(jué)缺失障礙得到明顯改善［9］更充分證明了其移植后定向性分化的問(wèn)題。來(lái)自血液學(xué)方面發(fā)現(xiàn)多能干細(xì)胞可來(lái)源于人外周血單核細(xì)胞，對(duì)iPSc 正向分化充分性研究得到證實(shí)；但其也可定向分化成樹(shù)突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞，從而對(duì)其逆向必要性研究也得到了進(jìn)一步證實(shí)［10］。最后是其移植后融合性方面研究：iPSc 來(lái)源的外泌體在心力衰竭的精準(zhǔn)治療為其移植后組織及細(xì)胞相融性提供了非常有力的依據(jù)［11］。

再者分析iPSc 移植后對(duì)受損心臟電重構(gòu)影響：Cx43 發(fā)生重構(gòu)，必然會(huì)引起心肌細(xì)胞的電耦聯(lián)障礙，導(dǎo)致急性心肌細(xì)胞損傷［12］。Cx43 表達(dá)增加可能是iPSc 移植后增加電活動(dòng)穩(wěn)定性主要原因之一。iPSc 移植后不僅可改善小鼠急性心肌梗死受損心肌的電重構(gòu)而且增強(qiáng)了其電位穩(wěn)定性，從電生理角度為心電圖ST-T 改變提供了直接依據(jù)。

iPSc 移植后改善基本電生理指標(biāo)ST-T 主要機(jī)制是其旁分泌作用。新近研究證實(shí)旁分泌是iPSc移植后修復(fù)受損心肌組織發(fā)揮作用主要方式，其作用機(jī)制將成為今后研究的重點(diǎn)方向［13］。但其作用因子及時(shí)間怎樣發(fā)揮作用還不清楚。其正向調(diào)整作用表現(xiàn)在對(duì)心肌細(xì)胞效應(yīng)持續(xù)時(shí)間正向調(diào)整作用，而心肌細(xì)胞亦可改善存活iPSc 離子通道功能從反方面亦很好的證實(shí)了旁分泌發(fā)揮的重用作用［14］，進(jìn)而改善急性缺血損傷心肌細(xì)胞的功能。新的研究顯示誘導(dǎo)多能干細(xì)胞移植后對(duì)帕金森患者的有益影響及早期的臨床應(yīng)用從神經(jīng)學(xué)方面再次證實(shí)了該移植細(xì)胞的有效作用［15］。iPSc 移植后2 周ST 壓低、T 波倒置分別與移植前（造模后）即刻及假手術(shù)對(duì)照組2 周比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而移植后1 周及3 周分別與前者及后者相同時(shí)間點(diǎn)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。心電圖ST-T 改善的這個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)為旁分泌作用產(chǎn)生一系列細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）及以上諸多因子在心肌修復(fù)方面發(fā)揮基礎(chǔ)作用［16］的研究提供了很好的路標(biāo)指引。同時(shí)心電圖ST-T 指標(biāo)改善為iPSc 移植后通過(guò)旁分泌產(chǎn)生的這些因子可增強(qiáng)急性缺血損傷心肌細(xì)胞電位穩(wěn)定性、改善并修復(fù)其功能提供了新的證據(jù)。

但iPSc 移植治療缺血性心肌病臨床應(yīng)用之路還很漫長(zhǎng)，有許多技術(shù)難題亟待解決：如為其臨床應(yīng)用提供最佳的種子細(xì)胞；研究外膜細(xì)胞移動(dòng)至不同組織進(jìn)而促進(jìn)血管再生的旁分泌作用機(jī)制等。iPSc 移植對(duì)受損心肌重構(gòu)及電重構(gòu)的影響，進(jìn)而改善其血供機(jī)制還需要進(jìn)一步臨床試驗(yàn)印證。