潘 艷，賀會利，馮世文，李 軍，袁翠平

（1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，南寧 530001；2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，南寧 530001）

鏈球菌（Streptococcus）是雙球形有莢膜的革蘭氏陽性球菌，廣泛分布在自然界中，具有較強的致病性和傳染性，多種動物易感，如豬、牛、羊、禽等，同時也是一種人獸共患傳染病［1］。羊鏈球菌病是由C 群溶血性鏈球菌引起的，羊只感染后可以引起敗血癥、肺炎及乳房炎。如果防控不及時會給養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失，還可能引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。近年來羊鏈球菌的發(fā)生率呈逐年上升趨勢［2］，需引起重視。多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）為革蘭氏陰性染色的細(xì)小球桿狀菌，根據(jù)莢膜抗原的不同將多殺性巴氏桿菌分為A、B、D、E、F 5 個血清型。不同的血清型特異感染宿主，感染山羊的血清型多為A 型和B 型［3］。多殺性巴氏桿菌可使多種動物易感，在家畜和野生動物中感染較為普遍［4］，不同種的動物間會相互傳染，人也可以被感染，羊感染后可出現(xiàn)呼吸道疾病和敗血癥，嚴(yán)重時可致死，需要及時采取措施，避免大規(guī)模的蔓延流行。通過對2020 年8 月，廣西某養(yǎng)殖戶送檢1 份羊病料，進(jìn)行細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)檢測，最終確定該病例是由鏈球菌與多殺性巴氏桿菌混合感染引起的，具體的診斷方法和報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病樣來源 廣西南寧市某羊場病羊突然死于圈舍內(nèi)，死后鼻孔出血。病程持續(xù)略長的病羊，精神沉郁，體溫升高到40.5 ℃，持久不退，呼吸急促，食欲減退或停食，有混雜血液的泡沫流出，死亡后腐敗較快。對病死羊剖檢可見，肺臟壞死嚴(yán)重，胃腸粘膜呈現(xiàn)出血性炎癥變化，脾臟、腎臟有大量出血點，肝臟腫大，質(zhì)地脆弱，腸系膜淋巴結(jié)腫大，小腸系膜出血嚴(yán)重，其他部位未見明顯異常。

1.1.2 實驗動物 昆明雄性小鼠10只，體重（20±2）g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.3 主要試劑與儀器 病毒DNA/RNA 提取試劑盒、2×TaqMasterMix、DL 2000 DNA Marker（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；瓊脂糖凝膠（西班牙GENE公司）；血平板培養(yǎng)基（鄭州安圖生物工程股份有限公司）；營養(yǎng)瓊脂（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；微量生化反應(yīng)管、藥敏紙片（杭州濱和微生物試劑有限公司）；PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad 公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）；小型臺式高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定 無菌條件下，采集病羊的肺臟、脾臟、小腸和淋巴結(jié)等組織樣品液，劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，對培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，挑取單個菌落，劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)基上，并對細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定。

1.2.2 16S rDNA 測序鑒定 將純化的菌株經(jīng)PCR擴增16S rDNA 序列后送至蘇州金唯智生物有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 藥敏試驗 采用NCCLS［5］推薦的K-B 紙片法，在無菌條件下，取100 μL 純化后培養(yǎng)的菌液均勻涂于普通瓊脂培養(yǎng)基上，選取青霉素類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等10 類共18 種常用抗菌藥物貼在培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h 后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑（Ф），判斷其耐藥性情況。

1.2.4 小鼠致病性試驗 選取健康昆明小鼠10 只，隨機分為試驗組和對照組，每組各5 只。將分離菌培養(yǎng)物按0.2 mL（濃度為109CFU/mL）接種于試驗組小鼠腹腔內(nèi)，對照組注射等量的生理鹽水，觀察并記錄小鼠的發(fā)病死亡情況。

1.2.5 引物設(shè)計與合成 參考文獻(xiàn)［6］至文獻(xiàn)［9］，將綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、肺炎克雷伯氏菌、化膿隱秘桿菌、溶血曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌的引物序列交由北京英俊生物工程公司合成（引物信息見表1）。

1.2.6 PCR 檢測 無菌采集適量羊的肺臟、脾臟、小腸和淋巴結(jié)等病料組織樣品研磨均勻，加入1.5 mL 滅菌生理鹽水，-20 ℃下反復(fù)凍融3 次，8 000 r/min離心10 min，取上清液，按照病毒DNA/RNA 提取試劑盒的說明書進(jìn)行抽提。以此DNA 為模板，分別以綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、肺炎克雷伯氏菌、化膿隱秘桿菌、溶血曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌引物對病料進(jìn)行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系為：2×EsTaqMasterMix 13 μL，上游引物、下游引物各1 μL（引物濃度25 pmol/μL），DNA 模板3 μL，ddH2O 7 μL，總反應(yīng)體系為25 μL。瞬時離心混勻，PCR 反應(yīng)程序為95 ℃5 min；95 ℃1 min，退火1 min（退火溫度見表1），72 ℃1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。

表1 引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征及染色結(jié)果

經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，可看到革蘭氏陽性球狀菌。挑取單個菌落接種于血瓊脂培養(yǎng)基平板上，結(jié)果在血瓊脂培養(yǎng)基上形成灰白色、中間隆起、邊緣呈鋸齒狀菌落，周圍有明顯的溶血區(qū)。

2.2 生化試驗結(jié)果

將已純化的革蘭氏陽性球狀菌接種于微量生化鑒定管中，37 ℃恒溫條件培養(yǎng)24 h，進(jìn)行生化試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)此病原菌可以發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖、木糖、覃糖，MR 試驗陰性，VP 試驗陰性，不能發(fā)酵山梨醇、棉子糖、甘露醇、菊糖，具有鏈球菌的生化特性，初步判斷為鏈球菌。

2.3 16S rDNA 測序

測序結(jié)果經(jīng)NCBI 比對，與公布的鏈球菌（登錄號：LC316906.1）同源性為98.99%，進(jìn)一步證實分離的菌株為鏈球菌。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果顯示，分離到的鏈球菌對青霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、土霉素、頭孢噻呋鈉高度敏感，對壯觀霉素、阿莫西林中度敏感，對鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星、卡那霉素、阿奇霉素等不敏感（表2）。

表2 藥敏試驗結(jié)果

2.5 小鼠致病性試驗

試驗組小鼠在接種6 h 后出現(xiàn)精神萎靡，18 h 后陸續(xù)死亡，最終死亡3 只，表明該菌有較強的致病性。解剖死亡小鼠，可見心包積液，心臟有出血點，肺出血，肝腫大并有壞死點。按照細(xì)菌學(xué)的方法進(jìn)行鑒定為鏈球菌感染。對照組小鼠精神狀態(tài)良好，無死亡，解剖未見病理變化。

2.6 PCR 擴增結(jié)果

用PCR的方法對病料樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果擴增出多殺性巴氏桿菌，未擴增出化膿隱秘桿菌、綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、溶血性曼氏桿菌、肺炎克雷伯氏菌，說明病料中檢測到多殺性巴氏桿菌（圖1）。

圖1 病料樣品的PCR 電泳結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本次病例經(jīng)細(xì)菌學(xué)檢測初步鑒定為鏈球菌感染，通過16S rDNA 測序確定該分離菌為鏈球菌，PCR 方法檢測為多殺性巴氏桿菌，臨床上疾病混合感染的概率逐漸增加，PCR 檢測技術(shù)具有靈敏度高、特異性強特點，臨床診斷需借助此技術(shù)同時進(jìn)行檢測，以免發(fā)生漏檢。通過藥敏試驗結(jié)果顯示，分離的鏈球菌對青霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、土霉素、頭孢噻呋鈉高度敏感，可以作為治療羊鏈球菌病的首選藥物，不建議使用鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星、卡那霉素、阿奇霉素等，合理用藥，防止濫用抗生素，導(dǎo)致耐藥性增加。致病性試驗結(jié)果顯示該菌具有較強的致病性，養(yǎng)殖場應(yīng)該高度重視，應(yīng)及時隔離并治療發(fā)病羊，對病死羊采取無害化處理，防止病原蔓延。用10%石灰乳或0.5%漂白粉徹底地消毒污染的圈舍、場地和飼具等，全群接種羊鏈球菌氫氧化鋁甲醛疫苗。對發(fā)病羊使用長效土霉素、頭孢噻呋鈉藥物治療，同時給予強心、補液，提高免疫力和抗應(yīng)激能力。

羊鏈球菌一般通過呼吸道傳播，為外源性傳染病，帶菌羊和病羊是該病的主要傳染源，該菌具有較強的傳染性，傳播速度也較快、傳染范圍很廣，不同年齡和品種的羊均可感染，且血清型較多，不同血清型之間的交叉保護(hù)能力低，如果采用單一的疫苗防控，很難達(dá)到有效的防控效果。目前還沒有有效根治羊鏈球菌病的方法［2］，在進(jìn)行診斷性治療中，一定要明確具體的致病原因，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果科學(xué)合理地使用抗菌藥物，避免盲目使用抗生素，確保治療的針對性和效果［9］。

多殺性巴氏桿菌屬于條件致病菌，臨床上較為常見，其血清型與致病性存在密切的關(guān)聯(lián)［10］，不同血清型感染的宿主也不相同，研究表明，感染山羊的多殺性巴氏桿菌有A 型、B 型和D 型［11，12］。目前，中國對多殺性巴氏桿菌的血清型研究較少。但不同的血清型之間交叉保護(hù)性較低［13］，首先確定多殺性巴氏桿菌的血清型對該病的防控尤為重要。本研究通過PCR 檢測方法，確定該病例為D 型多殺性巴氏桿菌，由于多殺性巴氏桿菌具有廣泛的耐藥性，給預(yù)防與治療羊巴氏桿菌病帶來一定的困難［14］。疫苗接種仍是防控多殺性巴氏桿菌的重要措施之一。

在日常養(yǎng)殖中，堅持自繁自養(yǎng)、全進(jìn)全出的養(yǎng)殖模式。嚴(yán)禁從疫區(qū)引種，在引種前一定要進(jìn)行嚴(yán)格的流行病學(xué)調(diào)查，保證引種的安全性、科學(xué)性、合理性。對發(fā)生過該類疾病的養(yǎng)殖場，在進(jìn)入冬季前，應(yīng)對全群進(jìn)行疫苗接種，同時保證羊舍清潔衛(wèi)生，日常養(yǎng)殖中應(yīng)保證飼料營養(yǎng)價值均衡，增強羊只的抵抗力。