劉 旭，陳洪濤，那次克道爾吉，何 云，曹 力

骨關(guān)節(jié)炎是一種中老年人群中常見(jiàn)的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨的退變?yōu)橹饕±砀淖?。軟骨退變?cè)缙谏性诳赡嫫?，后期逐漸出現(xiàn)軟骨缺損，進(jìn)而發(fā)展成不可逆損傷，晚期患者主要以手術(shù)治療為主[1-2]。Pagenstert et al(2009年)發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)分供應(yīng)缺失、異常機(jī)械負(fù)荷、創(chuàng)傷、遺傳傾向等多項(xiàng)因素均可導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。然而，目前臨床用于治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物大多只能起到緩解關(guān)節(jié)疼痛的作用，患者的關(guān)節(jié)損傷無(wú)法得到根本改善[3]，嚴(yán)重影響身體健康和生活質(zhì)量[4]。因此，發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上開展新的治療措施對(duì)治療骨關(guān)節(jié)炎意義重大。miR-375是一類內(nèi)源性、非編碼的小分子RNA，可調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，參與細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等多種生理過(guò)程，在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏性鼻炎、支氣管炎癥等疾病中發(fā)揮作用[5-7]，但其對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的作用尚未得知。2017年1月～2020年1月，我們收集60例行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織，并選擇20例正常軟骨組織作為對(duì)照進(jìn)行研究，旨在探討miR-375在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達(dá)及對(duì)骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期為臨床治療骨關(guān)節(jié)炎提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源 納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均符合《骨關(guān)節(jié)炎診療指南》[8]中有關(guān)膝骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并風(fēng)濕或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、化膿性關(guān)節(jié)炎等疾病。本研究納入60例，男31例，女29例，年齡48～70(64.55±6.34)歲。另選擇20例同期無(wú)骨關(guān)節(jié)炎病史者死后捐贈(zèng)的正常軟骨組織標(biāo)本(捐贈(zèng)者死后2 h內(nèi)取出股骨內(nèi)、外髁負(fù)重過(guò)渡區(qū)的軟骨組織，取出后立即置于-80 ℃的液氮中保存)，男9例，女11例，年齡50～75(66.90±9.03)歲。兩組性別比、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬均知情同意。

1.1.2主要試劑 DMEM培養(yǎng)基，甲苯胺藍(lán)染色液(上海索萊寶生物科技有限公司)，胎牛血清，青-鏈霉素混合液，0.25%的胰酶消化液，二甲基亞砜(DMSO,Gibco公司)，DEPC水(Sigma公司)，異丙醇，無(wú)水乙醇(上海振興化工一廠)，qRT-PCR試劑(DBI公司)，MTT(上海東仁化學(xué)科技有限公司)，Annexin V/PI染液(BD公司)，RIPA裂解液(上海申能博彩生物科技有限公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Thermo公司)，SDS-PAGE凝膠，電泳液，轉(zhuǎn)膜液，TBST(上海鈺森生物技術(shù)有限公司)，脫脂奶粉(上海國(guó)藥集團(tuán))，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore公司)，Bcl-2兔抗人單抗，Cleaved Caspase-3兔抗人單抗(Abcam公司)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、兔抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體及免疫熒光試劑盒(Santa Cruze公司)。

1.1.3主要儀器 超凈工作臺(tái)(Esco公司)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo electron corporation公司)，SpectraMax M5酶標(biāo)儀(Molecular device公司)，高速低溫離心機(jī)(Eppendorf公司)，PCR擴(kuò)增儀(Life technologies公司)，流式細(xì)胞儀(BD公司)，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(GE公司)，搖床(TS-8，上海精密儀器制造公司)，電泳儀，轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD公司)，TC處理細(xì)胞爬片24孔板、6孔板(上海索萊寶生物科技有限公司)。

1.2 骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

1.2.1骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 采用酶兩步法獲取骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，具體操作如下：將關(guān)節(jié)炎軟骨組織用磷酸鹽緩沖液清洗3次，仔細(xì)剔除附著滑膜、松質(zhì)骨等多余組織。隨后將其置于培養(yǎng)皿中并加入足量的DMEM培養(yǎng)基，迅速地切成約1 mm3大小的顆粒，加入胰蛋白酶，在37 ℃的搖床中消化30 min。待軟骨組織基本溶解，收集細(xì)胞懸液，以1 000 r/min離心8 min，小心棄去上清液，磷酸鹽緩沖液沖洗3次。后加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，制成關(guān)節(jié)炎軟骨單細(xì)胞懸液。

1.2.2骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞鑒定 ① 甲苯胺藍(lán)染色：將關(guān)節(jié)炎軟骨單細(xì)胞懸液用 4%甲醛固定，以甲苯胺藍(lán)染液進(jìn)行染色5 min，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并獲得圖像。② Ⅱ型膠原纖維染色：將關(guān)節(jié)炎軟骨單細(xì)胞懸液滴至爬片上，培養(yǎng)過(guò)夜后，使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定細(xì)胞進(jìn)行通透封閉，加入兔抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體于4 ℃孵育過(guò)夜。次日加入二抗后室溫避光孵育1 h，滴加封片劑1滴后封片，熒光顯微鏡檢查。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組將關(guān)節(jié)炎軟骨單細(xì)胞懸液(2×105個(gè))接種至6孔板，置于37 ℃恒溫，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度80%時(shí)，采用Lipofectamine 2000分別將miR-375 inhibitor和miR-375 NC轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞，并分為miR-375 inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-375 inhibitor)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染miR-375 NC)和空白對(duì)照組(不做任何處理)。

1.4 qRT-PCR方法檢測(cè)miR-375、Bcl-2和CleavedCaspase-3 mRNA的表達(dá)水平取0.5 cm×1.0 cm大小的骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織和正常骨關(guān)節(jié)軟骨組織樣本，于液氮中充分研磨，分別加入1 ml Trizol提取組織及細(xì)胞總RNA，室溫下放置5 min，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，miR-375以U6作為內(nèi)參，Bcl-2及Cleaved Caspase-3以β-actin為內(nèi)參。采用SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)miR-375的表達(dá)水平及各組細(xì)胞中Bcl-2和Cleaved Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1，每個(gè)樣品取10 μg cDNA，加入SYBR Green熒光染料。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢后進(jìn)行熔解曲線分析，根據(jù)內(nèi)參，按公式(2-ΔΔCt法)計(jì)算miR-375、Bcl-2和Cleaved Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平。

圖1 骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的鑒定 A.骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)(×200)；B.骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色(×200)；C.骨關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原纖維染色(×200)

表1 引物序列表

1.5 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，將0.5 g/L的MTT加入DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后去掉上清液，每孔加入100 μl的DMSO并輕震10 min，待其完全溶解后取出，使用酶標(biāo)儀于避光下570 nm處檢測(cè)吸光度，檢測(cè)3次，取平均值，判斷24、48、72、96 h時(shí)細(xì)胞的增殖能力。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(每樣本細(xì)胞數(shù)為2×107)，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒的操作步驟進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。將不含EDTA的0.25%胰酶加入培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞消化，以500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗滌1次，再以500～1 000 r/min離心5 min。用100 μl的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞。然后加入Annexin V和PI，室溫下避光孵育15 min，將處理好的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡水平。

1.7 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，加入裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)濃度，同樣品處理液混合后煮沸10 min，以每孔30 μg加樣，進(jìn)行凝膠電泳(12% SDS-PAGE)，設(shè)置電壓為80～120 V，2 h。后于4 ℃、2 mA/cm2穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)2 h；5%脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃ 下與Bcl-2、Cleaved Caspase-3稀釋的一抗(1 ∶2 000)中孵育過(guò)夜，洗掉一抗，隨后加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(1 ∶10 000)，孵育2 h。TBST膜清洗3次；ECL發(fā)光法顯影，X線片上獲得黑色條帶，應(yīng)用Quantity One 4.6.2檢測(cè)灰度值，計(jì)算Bcl-2、Cleaved Caspase-3條帶與β-actin條帶灰度值的比值。

2 結(jié)果

2.1 miR-375在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織和正常骨關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達(dá)miR-375的表達(dá)水平在正常軟骨組織中為0.54～0.80(0.65±0.07)，在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中為2.32～2.90(2.67±0.12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=71.85，P<0.05)。

2.2 骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的鑒定倒置顯微鏡下觀察骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)呈三角或多角等不規(guī)則形狀，向四周爬行生長(zhǎng)類似于成纖維細(xì)胞，見(jiàn)圖1A；甲苯胺藍(lán)染色顯示骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)異染呈淺藍(lán)色或紫紅色，見(jiàn)圖1B；Ⅱ型膠原纖維染色后，軟骨細(xì)胞及胞外基質(zhì)顯示為熒光，見(jiàn)圖1C。提示所提取培養(yǎng)的細(xì)胞為骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。

2.3 miR-375在各組骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)見(jiàn)圖2。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，miR-375 inhibitor組miR-375相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組各時(shí)段比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 miR-375在各組骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá) 與miR-375 inhibitor組比較：*P<0.05

2.4 MTT法檢測(cè)各組骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖能力見(jiàn)表2。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，miR-375 inhibitor組細(xì)胞在各時(shí)段的增殖能力均減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組各時(shí)段比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡情況見(jiàn)圖3。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，miR-375 inhibitor組細(xì)胞的凋亡率顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 qRT-PCR法和Western blot法檢測(cè)各組骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Bcl-2、Cleaved Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)見(jiàn)圖4、5。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，miR-375 inhibitor組Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，而Cleaved Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯增高(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組Bcl-2、Cleaved Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

正常生理狀態(tài)下，人體關(guān)節(jié)軟骨的合成和分解代謝保持著動(dòng)態(tài)平衡，軟骨以及軟骨下骨持續(xù)處于該種動(dòng)態(tài)改建過(guò)程中，從而維持人體關(guān)節(jié)的生理功能穩(wěn)定。然而，在骨關(guān)節(jié)炎患者中軟骨內(nèi)這一平衡被打破，進(jìn)而引起臨床的相應(yīng)癥狀[9]。隨著我國(guó)社會(huì)人口老齡化進(jìn)程的加劇，骨關(guān)節(jié)炎已成為老年人致畸致殘的重要因素。然而，目前對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，不能較完整地闡明其本質(zhì)。故研究骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制及軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控機(jī)制對(duì)預(yù)防、減緩及治療骨關(guān)節(jié)炎具有積極的意義。

miRNA 即微小RNA，是長(zhǎng)度17～25個(gè)核苷酸序列的單鏈RNA分子，其不參加轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)。研究[10]證實(shí)，miRNA對(duì)許多生命活動(dòng)起到了非常重要的調(diào)控作用，例如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和器官發(fā)育。miR-375定位于人2q35號(hào)染色體上，在進(jìn)化上高度保守。文獻(xiàn)[11-13]報(bào)道m(xù)iR-375在結(jié)直腸癌、口腔鱗癌、膠質(zhì)瘤等疾病中皆有異常表達(dá)，但在關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用尚不明確。本研究通過(guò)培養(yǎng)骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中miR-375的表達(dá)水平要明顯高于正常軟骨組織(P<0.05)，提示miR-375在骨關(guān)節(jié)炎中高表達(dá)。采用Lipofectamine 2000分別將miR-375 inhibitor和miR-375 NC轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞并分組，發(fā)現(xiàn)miR-375 inhibitor組miR-375表達(dá)水平較其他兩組明顯降低，提示轉(zhuǎn)染成功。MTT結(jié)果顯示miR-375 inhibitor組較其他兩組來(lái)說(shuō)，其各時(shí)段增殖能力被抑制，提示降低miR-375的表達(dá)能抑制骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖能力。值得注意的是，在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展過(guò)程中，軟骨細(xì)胞的過(guò)度凋亡對(duì)軟骨的破壞起到支配作用，并參與骨關(guān)節(jié)炎疾病的進(jìn)程。而Bcl-2和Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡的調(diào)控密切相關(guān)。相關(guān)研究[14]表明，缺氧條件下促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，同時(shí)抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)，誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，miR-375 inhibitor組Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平較其他兩組明顯降低，細(xì)胞凋亡率、Cleaved Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平較其他兩組顯著增高，提示降低miR-375能促進(jìn)骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與影響B(tài)cl-2及Cleaved Caspase-3表達(dá)水平有關(guān)。

表2 各組骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖能力的變化

圖3 各組骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡情況 A.流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖；B.定量圖，與miR-375 inhibitor組比較：*P<0.05

圖4 各組骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Bcl-2、Cleaved Caspase-3 mRNA表達(dá)水平 與miR-375 inhibitor組比較：*P<0.05

圖5 各組骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平 A.蛋白印跡圖；B.定量圖，與miR-375 inhibitor組比較：*P<0.05

綜上所述，miR-375在人骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中過(guò)表達(dá)，降低miR-375的表達(dá)可能通過(guò)影響B(tài)cl-2、Cleaved Caspase-3表達(dá)來(lái)抑制骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)其凋亡。