賀美宇 李兆勇 張晨陽 蘇友賢 楊少鋒*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410208

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨量減少、顯微結(jié)構(gòu)損壞，致使脆性骨折風(fēng)險增加為特征的全身性骨骼疾病[1]，其主要的臨床癥狀有疼痛、脊柱變形、骨折等[2]。2010年-2016年中國OP患病率流行病學(xué)Meta分析[3]提示，60歲以上人群OP總體患病率約為36%。隨著中國人口老齡化的不斷加劇，對于OP的治療使得醫(yī)療和社會經(jīng)濟(jì)效應(yīng)進(jìn)一步增加[4]。恒古骨傷愈合劑(osteoking,OK)是運用于骨折、骨質(zhì)疏松、骨折術(shù)后、骨關(guān)節(jié)病、腰椎間盤突出癥等方面的彝族藥方，多項臨床、基礎(chǔ)實驗證實其在改善骨密度、骨生物力學(xué)、促進(jìn)OP相關(guān)壓縮性骨折愈合等方面具有顯著療效[5-7]，為臨床治療OP提供新的選擇。但OK治療OP的具體作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究擬借助系統(tǒng)藥理學(xué)方法，探尋OK的藥物靶點，分析OK治療OP藥效成分的分子作用機(jī)制，為后期基礎(chǔ)研究提供思路。

1 材料和方法

1.1 獲取OK活性成分與基因靶點

應(yīng)用TCMSP[8]( https://tcmspw.com/tcmsp.php)分析工具，分別以“黃芪、人參、紅花、三七、杜仲、陳皮、鉆地風(fēng)”為檢索詞，檢索到的活性成分按照OB≥30%、DL≥0.18進(jìn)行篩選；通過化學(xué)數(shù)據(jù)庫[9](http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)的中藥與化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫檢索“鱉甲”活性成分；通過中國知網(wǎng)、萬方檢索關(guān)鍵詞為“鉆地風(fēng)”與“成分”的相關(guān)的文獻(xiàn)，篩選出文獻(xiàn)中闡述的活性成分。將檢索到的活性成分通過Swiss Target Prediction[10](http://new.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫分析相關(guān)基因靶點。

1.2 篩選OP致病靶點

通過GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(http：/www.omim.org/)、DisGeNET(http：//www.disgenet.org/)、TTD[11](http://db.idrblab.net/ttd/)等數(shù)據(jù)庫檢索OP相關(guān)的基因靶點，刪除重復(fù)檢索的數(shù)據(jù)。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與KEGG和GO分析

借助STRING(http：//STR-ING-db.org)和 Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建交集基因靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)。交互分?jǐn)?shù)最低要求>0.4被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義，本研究設(shè)定交互分?jǐn)?shù)為0.9。將交集基因靶點輸入DAVID和KEGG Mapping數(shù)據(jù)庫，設(shè)定閾值P<0.05。運用R軟件對OK-OP核心靶基因進(jìn)行GO富集分析柱狀圖。

1.4 “藥物-活性成分-疾病-靶點”模型構(gòu)建

利用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點”可視化模型；通過Network Analyzsis拓?fù)浞治鼍W(wǎng)路各節(jié)點的degree值，degree值越高，提示發(fā)揮主要作用概率越大。

1.5 分子對接模擬

從PDB數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org/)中下載靶點蛋白，借助PyMol去除水分子并摘取出自身配體。通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載活性成分3 D結(jié)構(gòu)文件。將靶點蛋白導(dǎo)入 Autodock Tools 1.5.6 軟件中加氫、計算總電荷、設(shè)置原子類型，保存為*pdbqt格式文件；利用Autodock Tools軟件將配體分子設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵后保存為*pdbqt格式文件。運行Vina對接，Grid box為原配體中心的周圍所有氨基酸殘基，選擇剛性對接，按照每個配體與受體對接的最優(yōu)結(jié)合能進(jìn)行排序，選取結(jié)合能最小的對接構(gòu)象導(dǎo)出*pdbqt格式文件。最后運用PyMol 軟件將對接構(gòu)象繪制可視化模型。

2 結(jié)果

2.1 篩選OK活性成分和靶蛋白信息

通過TCMSP、化學(xué)數(shù)據(jù)庫以及參考左國營[12]、曾光[13]有關(guān)“鉆地風(fēng)”活性成分的研究文獻(xiàn)，共篩選出180個活性成分，節(jié)選degree值前20的活性成分信息(表1)。選取度值排名前10個活性成分用于分子對接驗證。

表1 OK的活性成分信息(degree值前20)Table 1 Active ingredient information of OK (degree top of 20 )

2.2 OP致病靶點

通過GeneCards、OMIM、DisGeNET、TTD分別檢索出致病基因靶點數(shù)為4 273、10、1 098、34；去除重復(fù)的基因，并導(dǎo)入Uniprot(http://www.Uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Human”，剔除非人源靶點，最后得到4 661個OP致病基因靶點。

2.3 交集靶點獲取與Venny圖

借助Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，獲取到OK與OP的277個交集基因靶點(圖1)，將交集靶基因?qū)險niprot數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一ID。

圖1 恒古骨傷愈合劑-骨質(zhì)疏松癥 Venny圖Fig.1 OK-OP Venny diagram

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

借助STRING 與Cytoscape構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)；網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點277個，線條數(shù)5 704條，平均節(jié)點degree值41.2；其中發(fā)現(xiàn)絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、白蛋白(ALB)、白介素6(IL-6)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)等是整個網(wǎng)絡(luò)的核心蛋白，說明其在PPI互作網(wǎng)絡(luò)中占具重要地位，可作為OK治療OP的潛在靶點。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白Fig.2 The core proteins in the PPI network

2.5 GO 和 KEGG分析

GO功能富集分析結(jié)果提示：確定了2 655條生物學(xué)過程，主要牽涉有細(xì)胞對脂質(zhì)、有毒物質(zhì)、脂多糖、細(xì)菌源分子、無機(jī)物、有機(jī)環(huán)化合物、有機(jī)氮化合物的反應(yīng)等(圖3)。KEGG信號通路分析確定了272條結(jié)果，排除廣泛的信號通路，主要涉及：PI3K/Akt(40)、MAPK(31)、RAS(23)等信號通路(圖4)，提示OK可能通過以上多通路作用于OP。

圖3 生物學(xué)過程富集分析柱狀圖Fig.3 Histogram of biological process enrichment analysis

圖4 KEGG通路富集分析前20條結(jié)果Fig.4 The top of 20 result of pathway

2.6 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)模型

通過Cytoscape軟件構(gòu)建OK干預(yù)OP的活性“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)。其中菱形為組分藥物，八邊形為藥物活性成分，圓形為共有活性成分，六邊形為交集基因靶點。

圖5 藥物-活性成分-疾病-靶點互作網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Drug-active component-disease-target interaction network

2.7 分子對接模擬分析

選取受體蛋白及自身配體信息(表2)以及對接后配體與受體結(jié)合能(表3)。最低結(jié)合能小于-5.0 kJ·mol-1即表明活性分子與受體蛋白結(jié)合效果良好，結(jié)合能越低，表明結(jié)合能力越強。由表3結(jié)果提示熊果酸與四個受體蛋白結(jié)合能均小于-5.0 kJ·mol-1，并且與AKT1、ALB、IL-6結(jié)合能是活性成分中最低的，提示熊果酸可能在發(fā)揮藥效作用中起到重要作用。將對接結(jié)果利用PyMol軟件繪制模型圖(圖6)，由圖可知，熊果酸與AKT1在ARG-346處形成氫鍵，與ALB在LYS-195、ASN-295處形成氫鍵，與IL-6在ASN-61、LEU-62、GLU-172處形成氫鍵。

圖6 靶點蛋白和活性分子相互作用模型Fig.6 Interaction model between target protein and active molecule

表2 參與分子對接的受體蛋白信息

表3 OK中核心活性成分的分子對接(kJ·mol-1)

3 討論

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為OP的發(fā)生在中醫(yī)理論中與腎、肝、脾、血瘀等有關(guān)，其中以肝腎虧虛為主。腎為先天之本，主藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，故骨為腎所主；肝藏血，在體為筋，血養(yǎng)筋，筋司運動。故肝腎虧虛，勞耗精血，筋骨失養(yǎng)，乃生懈墮[14]。臨床OP患者多見全身疼痛，或某定處刺痛難忍，活動受限，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為機(jī)體內(nèi)氣血瘀滯，“不通則痛”；臥床日久，氣血不足，筋骨懈墮，脾氣虧虛，痰濕內(nèi)生，故可見四肢萎廢，納食欠佳，肺生痰濁等癥。OK是具有自主知識產(chǎn)權(quán)的民族藥物，組方包括黃芪、人參、紅花、三七、杜仲、鱉甲、陳皮、鉆地風(fēng)、洋金花。黃芪、人參補氣行氣；紅花、三七活血祛瘀，使瘀血去而新血生；杜仲補肝腎、壯筋骨；鱉甲滋陰填隨；陳皮行氣健脾，燥濕化痰；鉆地風(fēng)舒筋活絡(luò)；洋金花又稱曼陀羅花，其提取物可用于麻醉制劑，可祛風(fēng)除濕，解痙止痛。諸藥合用，共行補肝腎、益精血、健脾益氣、活血祛瘀、舒筋止痛之效。多項實驗[15-17]證明OK可有效促進(jìn)去勢動物骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化、成骨細(xì)胞增殖、成骨物質(zhì)形成、提高骨密度等，可能通過調(diào)節(jié)TGF-β/BMP-7、TGFβ/Smad、PI3K/AKT/GSK-3β等信號通路起到改善OP的作用。系統(tǒng)藥理學(xué)是分析藥物在藥物作用網(wǎng)絡(luò)與生物網(wǎng)絡(luò)相互作用關(guān)系，從而理解藥物和機(jī)體相互作用的科學(xué)[18]。借助目前理論與方法較為成熟的系統(tǒng)藥理學(xué)探索OK治療OP的作用機(jī)制，可為后期體內(nèi)外實驗設(shè)計與驗證提供思路與方向。

本研究在收集活性成分過程中，“鱉甲”與“鉆地風(fēng)”在TCMSP中無數(shù)據(jù)，但這兩種藥物是OK的特色藥物，本課題組綜合考慮決定在目前已有的國內(nèi)外文獻(xiàn)資料中篩選出“鱉甲”與“鉆地風(fēng)”的活性成分，并通過相關(guān)化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫排除不穩(wěn)定的、難以被人體吸收的或會被胃腸道分解的成分?；钚猿煞种衐egree值較高的有槲皮素、山奈酚 、反式十八烷酸、反11-二十碳烯酸、熊果酸、β-谷甾醇、委陵菜酸等。Zheng等[19]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測出熊果酸具有改善OP的潛力，隨后經(jīng)動物實驗驗證熊果酸對去卵巢大鼠OP有明顯的保護(hù)作用，體外細(xì)胞實驗證實熊果酸可阻斷自噬途徑在破骨細(xì)胞分化過程中被激活。槲皮素干預(yù)的低鈣高鎂飲食大鼠血清中血鈣量、血磷量、BALP水平明顯升高，血鎂量、BGP、CTX1、t PINP顯著降低，可能與槲皮素具有增加成骨細(xì)胞分化活性和可抑制破骨細(xì)胞骨吸收的功效相關(guān)[20]。山奈酚可通過降低miR-10a-3p，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子RUNX2、趨化因子CXCL12、成骨細(xì)胞分化和骨形成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Osterix的表達(dá)，促進(jìn)BMSC成骨分化，從而提高去卵巢大鼠的骨密度[21]。反式十八烷酸、反11-二十碳烯酸、β-谷甾醇、委陵菜酸未檢索到與OP相關(guān)研究文獻(xiàn)，其是否單獨或聯(lián)合對OP有作用，可為下一步藥理實驗提供選擇。PPI網(wǎng)絡(luò)中各靶點之間存在相互關(guān)聯(lián)、相互影響的復(fù)雜關(guān)系，研究提示OK可能主要作用于AKT1、ALB、IL-6、MAPK3等靶點蛋白，提示OK可能通過影響各靶點產(chǎn)生協(xié)同或抑制等綜合作用影響骨細(xì)胞功能，促進(jìn)成骨的發(fā)生，從而改善OP相關(guān)病理變化。Mukherjee等[22]通過培養(yǎng)AKT1基因敲除的骨髓基質(zhì)細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞的形成明顯受到抑制，提示AKT1是成骨細(xì)胞中一種獨特的信號中間產(chǎn)物，可以控制破骨細(xì)胞的分化。一項針對1 654例2型糖尿病患者ALB、HB與OP相關(guān)性的研究[23]表明，男性、女性ALB水平與OP危險比值比相關(guān)。IL-6可激活MAPK、PI3K/AKT等多條通路，激活破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨髓內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟骨細(xì)胞，是OP的重要預(yù)測因子之一[24]。

KEGG分析提示OK涉及PI3K/Akt、MAPK、RAS等多條信號通路作用于OP，不同的通路之間可存在相互協(xié)同作用。磷酸肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B (PI3K/AKT)為調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖、分化、存活、遷移和代謝等基本功能的最重要的信號通路之一[25]。Xi J等[26]運用特異性PI3K抑制劑LY294002阻斷PI3K/AKT轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞增殖、鈣積累、OCN成體、ALP活性和Runx2 mRNA的表達(dá)等被顯著抑制。張波等[27]通過藥物干預(yù)BMP、IL-1、1, 25 (OH)2D3、PTH、OPG、RANKL和雌激素等因子而作用于MAPK信號通路，可提高骨質(zhì)疏松癥的治療效果。肖浩[28]指出骨組織局部RAS系統(tǒng)過度激活時，可以抑制成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟和分化，或通過氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷成骨功能，結(jié)果可導(dǎo)致骨的吸收增加、形成減少，參與OP發(fā)生。

綜上，本研究借助系統(tǒng)藥理學(xué)方法初步明確了OK部分有效成分以及其通過多靶點、多通路參與促進(jìn)成骨、抑制破骨等作用，為臨床OK治療OP與預(yù)防OP相關(guān)壓縮性骨折提供了理論依據(jù)。