林喬 周鋼 黎靖毅 楊松 黃志鵬 毛漢儒 林堅(jiān)平

海南省人民醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，海南 ?？?570000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見于老年人的以骨密度減低和骨微結(jié)構(gòu)損壞為特征的疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國50歲以上人群中，女性O(shè)P的患病率為20.7%，男性為14.4%[2]。OP常導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折，據(jù)估計(jì)，全世界每年因骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的脆性骨折超890萬例[3]。根據(jù)預(yù)測(cè)，我國2035年用于治療脆性骨折的醫(yī)療費(fèi)用將高達(dá)1 320億元人民幣[2]?？梢?，OP為家庭和社會(huì)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，有必要深入研究促成骨的方法和機(jī)制，有效預(yù)防和治療OP。

低強(qiáng)度脈沖超聲(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)是一種具有非熱效應(yīng)的超聲，它以脈沖波的模式輸出，其強(qiáng)度較傳統(tǒng)超聲能量低(<3 W/cm2)[4]。LIPUS因其促成骨效應(yīng)已被美國FDA批準(zhǔn)用于促進(jìn)新鮮骨折的愈合和治療骨折的延遲愈合或不愈合[5]。機(jī)械敏感離子通道蛋白PIEZO1是一種非選擇性的陽離子通道蛋白[6]，可將細(xì)胞外的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡[7]。磷脂酰肌醇3激酶信號(hào)通路(PI3K/AKT/mTOR)被證實(shí)與成骨細(xì)胞的增殖活動(dòng)有關(guān)[8]。最新的研究表明機(jī)械敏感離子通道蛋白PIEZO1對(duì)其抑制劑Yoda-1的敏感性可經(jīng)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路調(diào)控[9]，因此，PIEZO1和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路存在著一定的關(guān)聯(lián)。綜上，筆者提出如下科學(xué)假設(shè)，即LIPUS可通過PIEZO1/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究設(shè)計(jì)并進(jìn)行了該實(shí)驗(yàn)，以期完善LIPUS的促成骨機(jī)制，尋找治療OP的潛在分子靶點(diǎn)和方法。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

MC3T3-E1成骨細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院)、α-MEM培養(yǎng)基、PBS(中杉金橋，中國)、胎牛血清、胰蛋白酶(Sigma，美國)、青霉素-鏈霉素雙抗溶液(博士德，中國)、PVDF膜(Millpore，德國)、ECL化學(xué)發(fā)光液(Pierce，美國)、β-actin一抗(中杉金橋，中國)、PIEZO1一抗(Novus，美國)、山羊抗兔二抗(中杉金橋，中國)、GsMTx4(Tocris，英國)、PI3K抗體(Abcam，英國)、Phospho-PI3K抗體(CST，美國)、AKT抗體(Abcam，英國)、Phospho-AKT抗體(CST，美國)、mTOR抗體(Abcam，英國)、Phospho-mTOR抗體(CST，美國)、重組Anti-Cyclin D1抗體(Abcam，英國)、CCK-8試劑盒(日本同仁)、低強(qiáng)度脈沖超聲儀(Metron GS170，澳大利亞)、電泳儀(伯樂，美國)、電轉(zhuǎn)儀(伯樂，美國)、臺(tái)式離心機(jī)(東旺儀器，中國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入4 mL完全培養(yǎng)基后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d換液一次(嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作)，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞長滿瓶底80%的區(qū)域時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 加載低強(qiáng)度脈沖超聲

時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和LIPUS組，將兩組細(xì)胞培養(yǎng)皿分別置于GS170超聲儀換能器下加載LIPUS，加載時(shí)間為1、6、12、18、24、36 h。機(jī)制實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、LIPUS組、LIPUS+GsMTx4組(PIEZO1的特異性抑制劑)和GsMTx4組，其中LIPUS+GsMTx4組的細(xì)胞在使用PIEZO1的特異性抑制劑GsMTx4處理后再加載LIPUS，而LIPUS組直接加載LIPUS。Metron GS170低強(qiáng)度脈沖超聲儀的參數(shù)為：脈沖頻率(100±3)Hz，脈沖寬度(2±3)ms，間隔時(shí)間(8±3)ms，脈沖占空比為1∶4(20)±3。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞取100 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，取CCK-8溶液10 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后測(cè)各組450 nm吸光度。

1.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

對(duì)各組細(xì)胞施加完干預(yù)措施后提取各組的總蛋白，測(cè)定上樣量后加入緩沖液煮沸，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。?biāo)準(zhǔn)制膠后依次向孔中加入Marker和各組樣本，設(shè)定好電泳參數(shù)后開始電泳，電泳結(jié)束后，將PVDF條帶敷于Marker指示的相應(yīng)分子量處開始電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)結(jié)束后將條帶置于相應(yīng)一抗試劑管中孵育1 h，4 ℃冰箱過夜，第二天在搖床上繼續(xù)孵育1 h后洗膜30 min，孵育二抗1 h，洗膜30 min后曝光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，WB條帶灰度值使用Image J測(cè)定，使用Graphpad Prism 8.0軟件制圖，統(tǒng)計(jì)方法使用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 LIPUS可促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖

使用CCK-8檢測(cè)MC3T3-E1成骨細(xì)胞在加載1、6、12、18、24、36 h的LIPUS后的增殖活力(見表1)，研究發(fā)現(xiàn)加載1 h和6 h LIPUS后MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖活力與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)，直到加載12 h LIPUS后，LIPUS組和對(duì)照組MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活力出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，加載LIPUS 18、24、36 h后兩組細(xì)胞的增殖活力均有顯著差異，但增殖活力均較12 h有所下降。綜上表明，LIPUS可顯著促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖活力，加載12 h時(shí)增殖活力最強(qiáng)。

表1 CCK-8檢測(cè)LIPUS組和對(duì)照組成骨細(xì)胞增殖活力(重復(fù)3次所得各組450 nm吸光度)

2.2 LIPUS通過PIEZO1促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖

研究發(fā)現(xiàn)LIPUS組PIEZO1的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，LIPUS組Cyclin D1的表達(dá)水平也顯著高于對(duì)照組(P<0.001)(詳細(xì)灰度值數(shù)據(jù)見表2)。這表明，LIPUS可能是通過上調(diào)PIEZO1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖。

表2 PIEZO1和Cyclin D1在LIPUS組和對(duì)照組的表達(dá)情況(重復(fù)3次條帶灰度值)

2.3 LIPUS通過PIEZO1/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖

各組蛋白表達(dá)情況見圖1A，研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS組p-PI3K的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，GsMTx4組顯著低于對(duì)照組(P<0.001)，LIPUS+GsMTx4組顯著低于LIPUS組(P<0.001)(圖1B)。如圖1C所示，各組間PI3K的表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)。此外，LIPUS組p-AKT的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，GsMTx4組顯著低于對(duì)照組(P<0.001)，LIPUS+GsMTx4組顯著低于LIPUS組(P<0.001)(圖1D)，而AKT的表達(dá)水平在各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1E)。p-mTOR的情況和p-AKT一樣，LIPUS組表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，GsMTx4組顯著低于對(duì)照組(P<0.001)，LIPUS+GsMTx4組顯著低于LIPUS組(P<0.001)(圖1F)，而各組間mTOR的表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)(圖1G)。研究還發(fā)現(xiàn)，LIPUS組Cyclin D1的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，GsMTx4組顯著低于對(duì)照組(P<0.001)，LIPUS+GsMTx4組顯著低于LIPUS組(P<0.001)(圖1H)。綜上表明，LIPUS可通過PIEZO1/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖。

圖1 p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR和Cyclin D1在對(duì)照組、LIPUS組、LIPUS+GsMTx4組和GsMTx4組的表達(dá)水平(ns P>0.05，**P<0.01，***P<0.001)Fig.1 The expression levels of p-PI3K, PI3K, p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR, and Cyclin D1 in the Control group, LIPUS group, LIPUS+GsMTx4 group, and GsMTx4 group (ns P>0.05, **P<0.01, ***P<0.001)

3 討論

雖然LIPUS促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的研究頗多[10-11]，但機(jī)制層面涉及PIEZO1的研究尚無，本研究首次證實(shí)LIPUS可通過調(diào)控PIEZO1的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路，從而促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)12 h的LIPUS可上調(diào)機(jī)械敏感離子通道蛋白PIEZO1的表達(dá)，進(jìn)而通過促進(jìn)PI3K的磷酸化，即上調(diào)p-PI3K的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)AKT的磷酸化，在p-AKT水平升高后又促進(jìn)p-mTOR的表達(dá)，從而促進(jìn)Cyclin D1的表達(dá)，促使細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期[12-13]，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。

機(jī)械敏感離子通道PIEZO1是骨骼發(fā)育和成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵物理傳感器，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨干細(xì)胞中PIEZO1的缺失會(huì)抑制骨骼發(fā)育，引起小鼠自發(fā)性骨折[14]。也有研究證實(shí)成骨細(xì)胞中PIEZO1的缺失會(huì)導(dǎo)致骨量減少和自發(fā)性骨折[15]。相反，對(duì)成年小鼠使用PIEZO1的激動(dòng)劑會(huì)增加小鼠骨骼質(zhì)量[16]。本研究也證實(shí)，上調(diào)PIEZO1的表達(dá)會(huì)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，相反，使用PIEZO1的特異性抑制劑GsMTx4會(huì)抑制MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果表明，PIEZO1對(duì)成骨細(xì)胞的分化和增殖甚至是機(jī)體骨骼發(fā)育至關(guān)重要。

近20多年來，骨折患者一直使用LIPUS作為輔助療法來促進(jìn)骨折愈合，美國FDA也已經(jīng)基于使用LIPUS患者的影像學(xué)結(jié)果將LIPUS批準(zhǔn)用于治療骨折或骨折不愈合[17]。LIPUS之所以能促進(jìn)骨折愈合，是因?yàn)樗茏饔糜诔晒羌?xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與礦化結(jié)節(jié)的形成，有研究發(fā)現(xiàn)，將成骨細(xì)胞MC3T3-E1暴露于1 MHz、0.2 W/cm2和20%的占空比的LIPUS 30 min，并分析細(xì)胞上清液中膠原蛋白、磷酸鹽、堿性磷酸酶和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的濃度，結(jié)果表明，LIPUS暴露后192 h，細(xì)胞上清液中的膠原蛋白、磷酸鹽和鈣水平降低。但堿性磷酸酶和TGF-β1的濃度保持不變，這說明LIPUS能夠通過鈣和磷酸鹽的吸收刺激MC3T3-E1前體成骨細(xì)胞的分化和礦化，從而形成礦化結(jié)節(jié)[18]。這在一定程度上闡述了LIPUS的促成骨機(jī)制，本研究也將LIPUS作用于MC3T3-E1成骨細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)LIPUS可通過PIEZO1激活PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。在一定程度上佐證了前人的研究，也進(jìn)一步完善了LIPUS的促成骨機(jī)制。

在正常細(xì)胞中，mTOR的活性受上游正負(fù)調(diào)節(jié)劑的調(diào)控。正性調(diào)節(jié)劑包括生長因子及其受體，例如胰島素樣生長因子-1及其受體、人表皮生長因子受體家族成員和相關(guān)配體、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體及其配體，可通過PI3K-AKT將信號(hào)傳遞至mTOR，從而發(fā)揮生物學(xué)功能[19-20]。本研究中，PIEZO1在感受到LIPUS的刺激后，會(huì)引起PI3K的磷酸化，p-PI3K會(huì)進(jìn)一步將信號(hào)傳遞至AKT和mTOR，活化的mTOR會(huì)進(jìn)一步參與細(xì)胞的增殖活動(dòng)。本研究發(fā)現(xiàn)LIPUS和PIEZO1也是mTOR活性的正性調(diào)節(jié)劑，也進(jìn)一步完善了mTOR活性變化的調(diào)控機(jī)制。

本研究系首次證實(shí)LIPUS可通過機(jī)械敏感離子通道蛋白PIEZO1進(jìn)一步活化PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，完善了LIPUS的促成骨機(jī)制，也為LIPUS治療局部骨質(zhì)疏松奠定了一定的理論基礎(chǔ)。當(dāng)然本研究也有諸多局限性，首先，沒有使用小干擾RNA沉默PIEZO1的表達(dá)，抑制劑抑制可能不徹底，可能對(duì)結(jié)果造成誤差；其次，僅在蛋白水平探討了LIPUS通過PIEZO1對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響，而沒有從基因水平深入研究，可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，低強(qiáng)度脈沖超聲可通過調(diào)控PIEZO1的表達(dá)經(jīng)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。