邱玲艷，王旭*

（1. 南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210029；2. 南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

糖尿病合并認知功能障礙（diabetic cognitive impairment，DCI）是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，超過40%的糖尿病患者會出現(xiàn)認知功能障礙的癥狀［1］。近期研究表明［2］，糖尿病患者出現(xiàn)認知功能障礙的風險是正常人的1.2~1.5倍，嚴重者可導致阿爾茨海默?。ˋlzheimer's Disease，AD），極大地影響了糖尿病患者的生存質量。流行病學研究表明［3］，未來糖尿病合并認知功能障礙將會是人們面臨的主要臨床問題之一，已引起了人們廣泛的關注。

中藥具有多成分、多靶點、多通路的特點，在對于糖尿病合并認知功能障礙的患者治療中具有明顯的優(yōu)勢［4］。中醫(yī)學認為糖尿病合并認知功能障礙的基本病機在于腎精虧虛，氣血虧虛，髓減腦消，治以滋養(yǎng)肝腎、補益氣血為主，佐以化痰、行氣、活血［5］。中藥黃精是補腎益氣的要藥，其性甘、平，亦可以調理心肺［6］，首見于《雷公炮炙論》；枸杞性甘、平，多用于滋補肝腎，首見于《本草綱目》。兩者作為治療糖尿病的常用藥［7］，也可組成藥方，源自《奇效良方卷之二十一·諸虛門》，稱為二精方，可以有效緩解神經退行性病變［8］，因此黃精－枸杞藥對可以作為糖尿病合并認知功能障礙的重要治療方藥。同時藥理學研究表明，黃精提取物具有保護肝腎功能、調節(jié)血糖、預防糖尿病并發(fā)癥的作用［6］，枸杞提取物具有降血糖、調血脂肪、抑制神經細胞凋亡［9-10］等多種藥理作用，兩者配伍可以更好地防治糖尿病合并認知功能障礙，但其具體的作用機制尚不明確。

本文基于網絡藥理學技術研究對黃精－枸杞藥對防治糖尿病合并認知功能障礙的潛在活性成分和作用靶點，進一步闡明其作用機制，并通過分子對接技術將黃精－枸杞藥對內化合物與受體虛擬分子結合發(fā)現(xiàn)其作用靶點和結合位點，為其治療糖尿病合并認知功能障礙提供更多可信度和實驗研究基礎。

1 資料與方法

1.1 黃精－枸杞藥對活性成分篩選及藥物靶點收集

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），獲取黃精－枸杞的活性成分，并將口服生物利用度（oral bioavailability，OB）設置為≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18進一步篩選出黃精－枸杞藥對的有效活性成分和作用靶點。再利用數(shù)據(jù)庫Uniprot將篩選出的靶點蛋白轉換為人類基因名。

1.2 DCI相關靶點的收集

以“Cognitive impairment of diabetes mellitu”為關鍵字在GeneCards、OMIM、PharmGkb 數(shù)據(jù)庫中進行相關基因的匯總并篩選、刪除重復基因。從GeneCards 數(shù)據(jù)庫篩選出的相關基因中進一步篩選出相關分數(shù)（Relevance scored）≥1分的靶點基因。

1.3 中藥調控網絡及蛋白互作網絡（PPI）的構建

運用R語言匯總分析中藥靶基因與疾病相關基因的交集，并繪制Venny 圖。通過軟件Cytoscapes 將黃精－枸杞的中藥成分與其靶基因的關系進行可視化，形成中藥調控網絡，其中基因節(jié)點越大代表與基因相關的藥物成分的數(shù)目越多。在STRING 平臺導入中藥靶基因與疾病相關基因的交集，在“Homo sapiens”屬性下，將minimun required interaction score 設置為≤0.9并刪除游離的基因，構建蛋白互作網絡。再利用CytoNCA 軟件計算中藥靶基因與疾病相關的交集基因的BC、CC、EC、DC、LAC、NC 分數(shù)，構建子網絡進一步篩選出PPI網絡的核心基因。

1.4 GO和KEGG分析

通過metascape 對數(shù)據(jù)進行GO 和KEGG 數(shù)據(jù)分析，顏色越紅說明網絡中基因在GO 富集中越顯著。GO 富集分析的目的在于分析調控網絡中的基因行使的功能。KEGG 富集分析的目的在于觀察調控網絡基因參與的通路。

1.5 分子對接

將核心基因與臨床陽性藥物利拉魯肽（Liraglutide）和核心活性成分的小分子配體進行分子對接，在pubchem 網站獲取小分子配體的2D 結構，利用Chem 3D 軟件生成3D 結構并優(yōu)化。然后利用Uniprot 搜索基因的蛋白并在PDB 網站獲取目標基因蛋白的三維結構，保存為PDB 格式。利用PYMOL 軟件去除蛋白受體三維結構的水分子和小分子配體。接著，通過Autodock Tools 給蛋白受體加氫并確定活性口袋，最后，利用活性口袋中心區(qū)域的數(shù)值，在vina 下進行分子對接并通過Pymol進行可視化。

2 結果

2.1 黃精－枸杞子藥對的活性成分及其相關靶點

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索及相關條件的篩選后得到黃精的活性成分12個，其相關作用靶點為148個，枸杞的活性成分45個，其作用靶點為364個。見表1。

表1 黃精－枸杞藥對活性成分

2.2 黃精－枸杞子藥對治療DCI作用靶點的篩選

通過數(shù)據(jù)庫GeneCards、OMIM、PharmGkb 數(shù)據(jù)庫檢索出疾病相關基因，通過https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/網站篩選出黃精－枸杞子藥對的潛在靶點與疾病相關靶點的交集并生成韋恩圖，見圖1，其中紫色為藥對相關基因，有196 個靶點基因，紅色為DCI相關基因為5 554個，兩者有167個共同的靶點基因。

圖1 疾病與藥物相關靶點的Venny圖

2.3 黃精－枸杞子藥對活性成分治療DCI 的中藥調控網絡

將中藥靶基因與疾病相關基因的交集導入Cytoscapes 軟件構建中藥調控網絡（見圖2），圓圈為中藥的成分其中綠色為枸杞子的活性成分，黃色為黃精的活性成分，矩形的藍色部分代表中藥的靶基因，藍色節(jié)點越大代表與基因相連的成分越多。槲皮素（quercetin）所間接的基因最多（122），有效活性成分較高，其次是黃芩素（baicalein）（25）、β－谷甾醇（betasitosterol）（24），β－谷甾醇是黃精、枸杞子公共的有效活性成分。

圖2 黃精－枸杞藥對靶基因與DCI相關基因的中藥調控網絡

2.4 構建蛋白互作網絡（PPI網絡）

在STRING 平臺導入數(shù)據(jù)，將最低相互評分設置為≤0.9，構建蛋白互作網絡見圖3，其PPI 網絡包涵618 條邊，167 個節(jié)點，淺藍色和紫紅色連線為已知的相互作用，綠色、深藍色和紅色連線為預測的相互作用。通過CytoNCA 軟件進一步計算篩選出PPI網絡中的13 個核心基因，見圖4，共有13 個節(jié)點，56 條邊。 基于degree分數(shù)，取前三為JUN（degree23）、MAPK1（degree23）、TP53（degree25），為分子對接做準備。

圖3 PPI蛋白互作網絡

圖4 核心基因的蛋白互作網絡

2.5 KEGG和GO富集分析

進行KEGG 富集分析（P< 0.05）可得到條目163條，可涉及的信號通路有AGE－RAGE 信號通路（AGE－RAGE signaling pathway in diabetic complications）、癌癥信號通路（Pathways in cancer）、前列腺癌信號通路（Prostate cancer）等，見圖5。基于metascape 進行GO 富集分析（P<0.05），X 軸為涉及的基因數(shù)，Y 軸為按P值大小排列的BP、CC、MF 名稱。其中生物學過程（BP）包括對有毒物質的反應（response to toxic substance）、氧化應激反應（response to oxidative stress）、對傷害的反應（response to wounding）等，細胞成分（CC）涉及膜筏（membrane raft）、胞質核周區(qū)（perinuclear region of cytoplasm）、突觸后（postsynapse）等，分子功能（MF）包括轉錄因子結合（transcription factor binding）、蛋白激酶結合（protein kinase binding）、蛋白結構域特異性結合（protein domain specific binding）等，見圖6。其中AGE－RAGE信號通路為rich factor 最高的通路即富集程度較高的通路，癌癥通路為富集程度最顯著的通路（見圖7），其中紅色為上調差異基因，綠色為下調差異基因。

圖5 KEGG富集分析通路圖

圖6 GO富集分析圖

圖7 ACE-RACE信號通路

2.6 分子對接

基于Drugbank數(shù)據(jù)庫與PPI網絡可獲得黃精－枸杞藥對的核心活性成分為黃芩素、槲皮素、β－谷甾醇，基于核心靶點為JUN、MAPK1、TP53。分別將兩者進行分子對接，研究結果見表2。結合能<－5 kcal/mol表示分子對接結果良好［11］。黃芩素、槲皮素、β－谷甾醇與靶點JUN、MAPK1、TP53分子對接的結合能都低于－20.5 kJ/mol，其中JUN與槲皮素結合能最低，為－30.96 kJ/mol（見圖8），MAPK1與β－谷甾醇結合最穩(wěn)定，結合能－36 kJ/mol（見圖9），TP53 與槲皮素結合最穩(wěn)定，結合能為－37.24 kJ/mol（見圖10），表明黃精－枸杞藥對的核心活性成分與糖尿病合并認知功能障礙核心靶點的分子對接結果良好。

圖8 JUN與quercetin

圖9 TP53與quercetin

圖10 MAPK1與beta－sitosterol

表2 黃精－枸杞藥對的核心活性成分與核心靶點的分子對接結果（kJ/mol）

3 討論

中醫(yī)古籍中并沒有糖尿病合并認知功能障礙的病名記載，但是根據(jù)其臨床表現(xiàn)可以將其歸屬于“癡呆”合并“消渴”的范疇，正如《圣濟總錄》提到“消渴日久，怔忡健忘”［12］。其病因在于腎精不足，腎陽虛衰，不能溫化水液，水液潴留，化濕為痰或腎氣不足，血行不暢，留滯為瘀，痰瘀日久，阻滯腦絡，腦為百神之會，腦絡受損則出現(xiàn)意識活動障礙［13］。徐虎軍［14］將糖尿病合并認知功能障礙的患者辨為陰虛陽亢證、氣血不足證、腑滯濁留證、熱毒內盛證和腎精虧虛證，研究表明糖尿病合并認知功能障礙為腎精虧虛證占80%，兩證相兼者占80.8%，三證及以上占57.3%，故治療多以補腎為主，加以行氣、化痰、活血，標本兼顧［5］。黃精－枸杞藥對作為補益腎精的常用藥對［15-16］還可以達到改善血糖［17］、保護神經細胞的作用［8］。王旭教授在通過多年的臨床研究觀察中總結出“糖脂清”方對于糖尿病合并認知功能障礙的患者療效顯著，黃精、枸杞作為其君藥起著主要的治療疾病的作用。但目前對于黃精－枸杞藥對治療糖尿病合并認知功能障礙的藥理學研究較少，因此本研究對黃精－枸杞藥對治療糖尿病合并認知功能障礙的作用機制、作用靶點進行了深入的分析。

基于《全球糖尿病概覽》（第八版）［18］，我國糖尿病人數(shù)為全球第一。隨著對于糖尿病合并認知功能障礙疾病的深入研究，已有研究表明［19］，糖尿病患者由于體內葡萄糖濃度的升高導致ROS 生成增加、TLR4 通路激活、炎癥介質釋放；在持續(xù)的炎癥反應下，出現(xiàn)巨噬細胞等免疫因子浸潤，進而導致胰島功能障礙，形成惡性循環(huán)。小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的組織巨噬細胞，參與神經炎癥［20］，是大腦的先天免疫細胞，與神經退行性改變密切相關［21］。Teemu Natunen 等進一步研究證實［22］，糖尿病會誘導小鼠海馬體中與神經退行性改變相關的小膠質細胞特異基因的異常表達。同時，免疫細胞分泌的IFN－細胞因子等免疫活性分子過表達CPR 等也會導致神經元受損，認知功能出現(xiàn)退行性改變［23］。此外，研究表明［24］糖尿病合并認知功能障礙可能與Ca2+失調、血腦屏障受損、糖尿病腦損傷、免疫炎癥機制、胰島素功能受損有關。這對于研究中藥治療糖尿病合并認知功能障礙具有較大的意義。

本研究通過TCMSP平臺篩選出黃精－枸杞的有效成分12個，通過PPI網絡獲得與糖尿病合并認知功能障礙相關靶基因關聯(lián)性較強的藥物活性成分主要有黃芩素（baicalein）、β－谷甾醇（beta－sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）、槲皮素（quercetin）等。槲皮素、黃芩素作為黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、降糖等作用，對神經退行性疾?。?5］及2型糖尿?。?6］等多種疾病療效顯著。黃酮類化合物與MAPK1激酶相互作用還可以保護神經，增強記憶功能［27］。研究表明［28］，黃芩素可以通過改善高糖誘所導致的血腦屏障受損達到保護糖尿病中樞神經系統(tǒng)的作用。槲皮素最顯著的作用在于抑制炎癥因子，降低氧化應激反應，調節(jié)炎癥反應［29］。β－谷甾醇和豆甾醇都屬于類固醇，又可以稱為“腎上腺皮質素”，可以有效抗高膽固醇、神經細胞炎癥，提高抗氧化和調節(jié)血糖［30-31］。

黃精－枸杞藥對與糖尿病合并認知功能障礙的交集基因共有164 個，主要作用靶點有JUN（AP－1）、FOS、MAPK1、MYC、TP53 等。轉錄調節(jié)因子JUN（AP－1）、FOS 是轉錄因子激活蛋白－1（AP－1）家族的成員，參與調控T 淋巴細胞等多種細胞的產生、增殖、活化［32］。研究表明［33］，JUN（AP－1）可以激活小膠質細胞和促進巨噬細胞炎癥活化。AP－1上游的調控因子JNK 磷酸化C－Jun 蛋白參與MAPK 級聯(lián)反應是產生炎癥反應的重要途徑［34］。DENG Y 等［35］通過抑制MAPK1可以有效減少海馬細胞的凋亡，改善認知功能障礙。癌基因MYC、腫瘤蛋白TP53 同屬于控制凋亡調節(jié)蛋白表達的轉錄因子，主要作用于調控細胞的生長、增殖、凋亡［36］，C－myc 有助于抑制神經毒性［37］，N－myc下游調控系統(tǒng)通過增加MMP－3的表達和分泌，調節(jié)血腦屏障和免疫細胞的滲透性［38］，可涉及多種神經系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制［39］。LACROIX M 等［40］實驗發(fā)現(xiàn)，TP53 既可以參與胰島β 細胞凋亡，胰島素抵抗，氧化應激等與糖尿病相關的生物過程，也參與調控FXN，進而導致神經細胞的凋亡，與糖尿病合并認知功能障礙關系密切。

基于GO和KEGG富集分析，將黃精－枸杞藥對治療糖尿病合并認知功能障礙相關的通路分數(shù)排在前20 位的通路分為疾病通路、有機系統(tǒng)通路和環(huán)境信息處理通路。疾病通路包括糖尿病并發(fā)癥AGE－RAGE信號通路、乙型肝炎信號通路、癌癥相關通路等。有機系統(tǒng)主要可分為免疫系統(tǒng)（IL－17 信號通路）、神經系統(tǒng)（Dopaminergic synapse）與內分泌系統(tǒng)（脂肪細胞因子信號通路等）。環(huán)境信息處理主要為信號傳導包括NF－kappa B 信號通路與MAPK 信號通路。其主要的分子過程為與轉錄因子、蛋白激酶的結合，可知黃精－枸杞藥對治療糖尿病合并認知功能障礙主要涉及神經內分泌免疫網絡，是多通路、多靶點的。神經內分泌免疫網絡起源于1977年由Basedovsky 提出，與中醫(yī)整體觀，臟腑氣血功能不足導致臟腑疾病發(fā)生的論點相一致［41］。黃精－枸杞藥對治療糖尿病合并認知功能障主要以補腎為主，腎為先天之本，主藏精，精化氣，氣生血；精生髓，髓化血，氣血不足，臟腑功能衰退，腦絡不榮，認知功能衰退。藥對通過治療神經炎癥、胰島素抵抗、炎癥反應等，立足于神經內分泌免疫網絡，可以有效治療糖尿病合并認知功能障礙。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃精－枸杞藥對治療糖尿病合并認知功能障礙有效成分主要為黃芩素、β－谷甾醇、豆甾醇和槲皮素，主要作用于靶點JUN、MAPK1、TP53、FOS，參與免疫、信號傳導、病毒相關的多種通路，立足于神經內分泌免疫網絡，具有良好的抗炎、調節(jié)免疫、修復血腦屏障的作用。但本研究尚存在一些不足之處，在后續(xù)的實驗研究中也需要進一步驗證黃精－枸杞藥對治療糖尿病合并認知功能障礙的有效靶點和通路，以便更好地進行對疾病的防治工作。