陳曉鈺，黃子慧，錢佳燕，孫佳玥，陳思琪，曹麗敏

（南京中醫(yī)藥大學附屬南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇 南京 210021）

結核性潰瘍是指結核分枝桿菌（MTB）經各種傳播路徑侵犯機體局部組織，引起病灶周圍軟組織、皮下及皮膚的壞死，最終液化破潰所形成的創(chuàng)面［1-2］，是臨床最為常見的一種特異性感染性創(chuàng)面。春季為本病的高發(fā)季節(jié)，多見于年輕女性，臨床表現(xiàn)為創(chuàng)面化膿流水，易形成竇道，創(chuàng)面不易愈合或假性愈合后反復發(fā)作、破潰流膿［3］。該病治療頗為棘手，目前臨床多采用抗結核藥配合局部外用換藥的治療方案。復方五鳳草液是臨床應用較為成熟的外用中藥［4］，由南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院瘰疬科黃子慧主任總結科室名老中醫(yī)治療本病幾十年經驗所得，具有泄毒生新之功，臨床使用多年，療效顯著。本課題組前期已開展復方五鳳草液的相關機制研究，通過觀察M1、M2 型巨噬細胞的表型指標iNOS、Arg－1，發(fā)現(xiàn)復方五鳳草液能促進Arg－1 表達、抑制iNOS 的過度表達［5-6］。為進一步從巨噬細胞極化平衡角度探析復方五鳳草液的促愈合機制，課題組開展了對結核性潰瘍患者血清、組織中巨噬細胞調控因子MDM2、p53 的研究，研究結果如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象為2020年1月1日—2020年12月31日期間經南京中醫(yī)藥大學附屬南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院通過病理學證實為結核性潰瘍患者76 例，隨機分為實驗組和對照組。其中實驗組中男性16 例，女性22 例，年齡20～75 歲；對照組中男性18 例，女性20 例，年齡19～73 歲。兩組患者性別分布及年齡分布經統(tǒng)計學處理，差異均無統(tǒng)計學意義，具有可比性。

1.2 給藥

實驗組：基礎抗結核化學治療+ 復方五鳳草液（組成：五鳳草2 000 g，白及240 g，貓爪草400 g，由南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院中藥制劑室提供），外用。

對照組：基礎抗結核化學治療+康復新液（四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責任公司，國藥準字Z51021834），外用。

基礎抗結核化學治療方案：3HREZ/9～15HRE 或3HRSZ/9～15HRE。

外用藥物使用方法：根據創(chuàng)面大小剪取適當面積無菌棉片，以復方五鳳草液或康復新液浸濕（注意以輕擠不滴水為宜）外敷，大致為0.5 mL/cm2，若有竇道則將棉片深入竇道內，2 d換藥1次。共治療28 d。

1.3 主要試劑及儀器

MDM2 ELISA檢測試劑盒（JL45544）；人p53 ELISA 檢測試劑盒（JL12676）；TRIzolTM LS Reagent（Thermo Fisher Scientific，10296010）；PrimeScript?PT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒（Takara，RR036A）；ChamQ ?SYBR?qPCR Master Mix（Without ROX）試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，Q321－02）；RIPA（放射免疫沉淀法）蛋白裂解液（Beyotime，Henan，China，P0013C）；BCA 試劑盒（碧云天生物技術有限公司，中國，P0010S）；MDM2 兔抗人單克隆抗體（Affinity Biosciences，OH，USA，AF0208）；p53兔抗人單克隆抗體（Affinity Biosciences，OH，USA，AF0879）；二抗（Affinity Biosciences，OH，USA，S0001）。

酶標儀（美國BioTek 儀器有限公司，Victor3 plate reader）；實時熒光定量PCR儀（羅氏，LightCycler 480）；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒，DHG－9031）；臺式高速冷凍離心機（Sigma，1－21K）。

1.4 方法

1.4.1 治療前及治療后第3、7、14、28 天的創(chuàng)面愈合率

通過掃描儀將創(chuàng)面情況錄入微型計算機，采用Osiris 4.19 軟件計算像素的方法進行創(chuàng)面面積計算。潰瘍原始創(chuàng)面面積為第一次測量的創(chuàng)面面積，時相點未愈合面積為各時相點取材時測量的面積［4］。

創(chuàng)面愈合率（%）=（原始創(chuàng)面面積－時相點未愈合面積）/原始創(chuàng)面面積×100%

1.4.2 創(chuàng)面腐去時間及上皮生長時間

創(chuàng)面腐去時間：從創(chuàng)面初始用藥到創(chuàng)面腐肉盡脫所需時間；上皮生長時間：從創(chuàng)面用藥起到新肉長出所需時間。如患者在治療結束后第28 天時仍有未完全脫盡的腐肉，則該患者的創(chuàng)面腐去時間按28 d計算。

1.4.3 ELISA 法檢測兩組患者血漿中MDM2、p53 蛋白表達情況

于受試者治療前及治療后第3、7、14、28 天分別取1 mL 的全血置于EDTA 抗凝管里，離心取得上層血漿樣本，根據ELISA試劑盒說明書中的要求進行實驗，根據標準曲線計算出各檢測標本中相應指標的含量。

1.4.4 RT－qPCR 法檢測兩組患者血漿中MDM2、p53 mRNA表達情況

于受試者治療前及治療后第3、7、14、28 天分別取1 mL的全血置于EDTA抗凝管里離心取上層血漿。提取并測定血漿RNA 濃度，根據試劑盒說明書加入所需試劑，逆轉錄合成cDNA。使用ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix（Without ROX）試劑盒進行RT－PCR 反應，測定MDM2、p53 mRNA表達水平。

所有引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列見表1。

表1 Real－time PCR檢測引物列表

1.4.5 Western Blot 法檢測兩組患者創(chuàng)面組織中MDM2、p53蛋白表達情況

于受試者治療前與治療后第28 天換藥時收集創(chuàng)面組織，從組織中提取總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度后使蛋白變性；計算蛋白上樣量，SDS－PAGE 膠電泳后轉膜；封閉（脫色搖床，1 h）、敷一抗（4 ℃冰箱，脫色搖床，過夜）；洗去一抗，室溫條件下敷二抗（脫色搖床，1.5 h），再次洗膜，用化學發(fā)光法暴露膜上的蛋白帶。

1.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量數據采用均數± 標準差（xˉ±s）表示，以P< 0.05 代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者創(chuàng)面愈合率情況比較

隨著治療時間的增加，兩組創(chuàng)面均逐漸愈合，第14 天起愈合趨勢明顯。與治療后第7 天比較，兩組患者治療后第14、28 天的創(chuàng)面愈合率明顯升高（P<0.05）；與對照組比較，在治療后第28 天時，實驗組的創(chuàng)面愈合率明顯升高（P<0.05）。見表2。

表2 兩組患者創(chuàng)面愈合率變化比較（±s，%）

表2 兩組患者創(chuàng)面愈合率變化比較（±s，%）

注：與本組治療后第7天比較，*P<0.05；與對照組同一時間比較，#P<0.05。

組別實驗組對照組例數38 38第3天15.50±8.23 13.37±7.45第7天26.76±6.87 21.35±8.26第14天47.70±11.01*36.77±13.65*第28天90.17±7.38*#61.05±18.71*

2.2 兩組患者創(chuàng)面腐去時間及上皮生長時間

與對照組比較，實驗組的創(chuàng)面腐去時間及上皮生長時間均明顯縮短（P<0.05）。見表3。

表3 兩組患者創(chuàng)面腐去時間、上皮生長時間比較（±s，d）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別實驗組對照組例數38 38腐去時間19.67±3.07*25.34±5.38上皮生長時間12.34±4.23*17.76±6.28

2.3 ELISA 法檢測兩組患者治療前后血漿中MDM2、p53蛋白表達情況

組內不同時間點比較，與治療前相比，第7、14、28 天時，實驗組與對照組血漿中MDM2 蛋白表達水平均升高（P< 0.05），p53 蛋白表達水平均降低（P<0.05）。組間同一時間點比較，治療前與治療后第3 天時，實驗組與對照組血漿中MDM2、p53 蛋白表達情況差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）；第7、14、28 天時，與對照組相比，實驗組血漿中MDM2 蛋白表達水平明顯升高，p53 蛋白表達水平明顯降低（P< 0.05）。見表4。

表4 兩組患者血漿中MDM2、p53蛋白含量比較（±s，pg/mL）

表4 兩組患者血漿中MDM2、p53蛋白含量比較（±s，pg/mL）

注：與同組治療前比較，#P<0.05；與對照組同一時間點比較，*P<0.05。

組別實驗組對照組例數38 38時間治療前第3天第7天第14天第28天治療前第3天第7天第14天第28天MDM2 3.87±0.95 4.32±0.77 6.06±1.75#*8.24±1.50#*10.76±1.78#*3.73±0.79 4.02±0.89 5.05±1.11#6.38±1.16#7.58±1.17#p53 482.52±100.36 408.78±93.90 298.16±68.55#*206.38±22.88#*106.18±15.64#*461.53±104.56 440.54±78.89 389.07±89.44#296.03±59.41#184.46±54.08#

2.4 RT－qPCR 法檢測兩組患者治療前后血漿中MDM2、p53 mRNA表達情況比較

組內不同時間點比較，與治療前相比，第7、14、28 天時，實驗組與對照組血漿中MDM2 mRNA 表達水平均升高（P< 0.05），p53 mRNA 表達水平均降低（P< 0.05）。治療前與治療后第3 天時，實驗組與對照組血漿中MDM2、p53 mRNA 表達情況差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）；第7、14、28 天時，與對照組相比，實驗組血漿中MDM2 mRNA 表達水平明顯升高，p53 mRNA 表達水平明顯降低（P< 0.05）。見表5。

表5 兩組患者血漿中MDM2、p53 mRNA含量比較（±s，pg/mL）

表5 兩組患者血漿中MDM2、p53 mRNA含量比較（±s，pg/mL）

注：與同組治療前比較，#P<0.05；與對照組同一時間點比較，*P<0.05。

組別實驗組對照組例數38 38時間治療前第3天第7天第14天第28天治療前第3天第7天第14天第28天MDM2 0.21±0.06 0.30±0.03 1.00±0.21#*1.35±0.24#*1.80±0.21#*0.22±0.04 0.26±0.04 0.44±0.06#0.65±0.08#1.12±0.05#p53 2.09±0.28 1.92±0.26 1.19±0.29#*0.60±0.11#*0.13±0.03#*2.16±0.25 2.00±0.30 1.63±0.28#0.85±0.22#0.38±0.08#

2.5 兩組患者治療前后創(chuàng)面組織中MDM2、p53 蛋白表達情況比較

與治療前相比，兩組患者治療后創(chuàng)面組織中MDM2 蛋白表達水平均升高，p53 蛋白表達水平均降低；與對照組相比，實驗組創(chuàng)面組織中MDM2、p53蛋白表達改善更明顯。見圖1。

圖1 兩組患者創(chuàng)面組織中MDM2、p53蛋白表達情況

3 討論

結核性潰瘍屬于臨床常見的肺外結核，在2018年世界衛(wèi)生組織確認的630 萬新發(fā)結核病例中，肺外結核約占16%［7］，而結核性潰瘍占全部肺外結核的30%～40%［8-9］，其構成比遠高于糖尿病足及壓瘡的發(fā)生率［10］。作為一種臨床最為常見的特異性感染性創(chuàng)面，其治療歷來屬外科難題。在慢性創(chuàng)面的修復中，中醫(yī)藥治療具有明顯優(yōu)勢。中醫(yī)學認為，在該病發(fā)生、發(fā)展的過程中，癆瘥毒邪入侵和機體正氣虧虛二者共同作用，互為因果。癆瘥毒邪熾盛，滯于肌表，導致氣滯血瘀，日久肉腐成膿，進而潰破；脾胃虛弱，氣血虧虛，無力托毒外出，創(chuàng)面破潰難斂；創(chuàng)面日久不斂則致虛損進一步加重，導致惡性循環(huán)，令本病遷延難愈［6］。

復方五鳳草液為名老中醫(yī)驗方，在多年的臨床實踐中取得穩(wěn)定療效。方中重用五鳳草行水殺蟲，祛腐泄毒；白及斂瘡消腫，生肌止血；貓爪草拔膿解毒，活血生新，共奏泄毒祛腐，生新活血之功效。課題組既往研究結果表明該藥物的作用機制可能與調控巨噬細胞極化失衡有關［5］。

目前已知在參與慢性創(chuàng)面修復的眾多細胞中，巨噬細胞起到了總指揮的作用［11］。不同的微環(huán)境下巨噬細胞可極化為M1和M2兩種不同類型［12］，M1型主要參與炎癥產生的起始和維持過程，通常出現(xiàn)在創(chuàng)面愈合的早期；M2 型在組織修復［13］、促進創(chuàng)面細胞增殖和血管化的形成中起到重要作用，M1 向M2 型轉換是創(chuàng)面由炎癥反應轉為修復性反應的關鍵［14］。有研究表明，在TU 創(chuàng)面組織液化高峰期，創(chuàng)面組織中M1 型巨噬細胞顯著高于M2 型，即M1 型募集、M2 型損耗的混合極化狀態(tài)［15］。

在調節(jié)巨噬細胞極化的諸多通路中，PI3K/AKt 信號轉導通路是許多重要細胞功能信號傳遞的中心，包括細胞黏附、遷移和血管生成［16-18］，其中調控因子MDM2、p53 與創(chuàng)面愈合聯(lián)系密切。THOMASOVA 等［19］發(fā)現(xiàn)，MDM2 阻斷抑制了缺血后促炎細胞因子和趨化因子的誘導，阻礙了白細胞向損傷部位的募集。ANKE 等［20］的研究結果表明，p53 能夠激活親氧化劑，促進自噬和抗氧化反應［21］，調節(jié)細胞修復、衰老、DNA損傷識別、增殖和遷移［22］，進而刺激皮膚中的核相關因子2（Nrf2）途徑，導致谷胱甘肽含量增加，從而提高皮膚愈合的質量［23-24］。

本次研究通過設立藥物對照組，動態(tài)觀察結核性潰瘍患者血漿、組織中巨噬細胞PI3K/AKt 信號轉導通路中兩個重要調控因子MDM2、p53 的表達水平，進一步探析復方五鳳草液的作用機制。結果顯示，隨著治療進展，兩組創(chuàng)面都呈現(xiàn)逐漸愈合的趨勢，實驗組愈合率明顯高于對照組，腐去時間與上皮生長時間均明顯短于對照組。在治療初期，兩組患者血漿中MDM2、p53蛋白及mRNA 表達水平無明顯差異；自治療第7天起，隨著創(chuàng)面愈合率的增加，MDM2蛋白及mRNA 表達逐漸升高、p53 蛋白及mRNA 表達逐漸降低，較之前相比均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；組間同時間比較，與對照組相比，第7、14、28天時實驗組MDM2蛋白及mRNA 表達水平明顯升高（P< 0.05），p53 蛋白及mRNA 表達水平明顯降低（P< 0.05）。通過Western Blot 法驗證兩組患者潰瘍組織中MDM2、p53 蛋白表達水平，結果治療前兩組患者創(chuàng)面組織中MDM2、p53 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義，治療后均可見MDM2蛋白水平升高、p53 蛋白水平降低，且實驗組的改善情況優(yōu)于對照組，得出血漿與組織中MDM2、p53 同步變化這一結論。

本研究通過在體實驗觀察了復方五鳳草液對結核性潰瘍患者MDM2、p53 表達情況的影響，結果復方五鳳草液顯著促進了結核性潰瘍的愈合，隨治療時間的增加，創(chuàng)面腐肉日漸脫落，血漿與創(chuàng)面組織中p53 表達逐漸降低；上皮逐步生長，MDM2表達逐漸提高。由此我們推測結核性潰瘍創(chuàng)面愈合緩慢可能與MDM2－p53 表達失衡、巨噬細胞M1/M2 極化失衡有關，而復方五鳳草液促進結核性潰瘍創(chuàng)面愈合可能是通過上調MDM2 表達、下調p53 表達，進而平衡M1/M2 來實現(xiàn)的。此次實驗尚有不足之處，并未有數據直接證明MDM2、p53 之間具體的調控關系，此后課題組將繼續(xù)開展細胞及動物實驗，多角度深入闡明結核性潰瘍的發(fā)病機制以及復方五鳳草液促進創(chuàng)面愈合的可能作用機制。