王佶 楊崢 李海林

肺腺癌是肺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型，是人類(lèi)因癌 癥死亡的主要原因之一[1]。盡管目前肺腺癌的治療手段較多，包括靶向治療、免疫治療等，但面對(duì)晚期肺腺癌，治療結(jié)果仍難以令人滿(mǎn)意。相較于肺鱗狀細(xì)胞癌，肺腺癌主要發(fā)生在末端細(xì)支氣管和肺泡內(nèi)，很難用支氣管鏡檢查[2]。因此，肺腺癌的早期階段更加難以識(shí)別，如何盡早診斷肺腺癌就顯得尤為重要。了解肺腺癌的潛在發(fā)病機(jī)制將為發(fā)現(xiàn)早期診斷性生物標(biāo)志物提供新的見(jiàn)解，從而為肺腺癌患者提供個(gè)體化的治療策略。

抗沉默功能蛋白1（anti-silencing function 1,ASF1）最初在酵母中被發(fā)現(xiàn)，屬于組蛋白H3-H4伴侶蛋白[3]。ASF1在組蛋白的聚合、轉(zhuǎn)運(yùn)、修飾等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[4]。ASF1有2個(gè)主要的亞型，分別是ASF1A和ASF1B[5]。已有研究顯示ASF1B在乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌等腫瘤中異常表達(dá)，有望成為多種惡性腫瘤新的預(yù)后因子[6-8]。然而在肺腺癌中，ASF1B基因表達(dá)及其臨床意義尚不清楚。本研究基于生物信息學(xué)分析ASF1B基因在肺腺癌中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響，初步探索ASF1B參與肺腺癌進(jìn)程的潛在分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.oncomine.org/resource/login.html）的一項(xiàng)重要功能就是進(jìn)行腫瘤組織和癌旁正常組織的基因表達(dá)差異分析。本研究設(shè)置的檢索條件如下：（1）Gene：ASF1B；（2）Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis；（3）Date Type：mRNA；（4）臨界值設(shè)定條件（P＜0.0001，fold change 2，gene rank=Top10%）。

1.2 基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（gene expression profiling interactive analysis,GEPIA2）數(shù)據(jù)庫(kù)分析 GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）是北京大學(xué)張澤民教授實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的一個(gè)網(wǎng)站，能夠?qū)δ[瘤基因圖譜（the cancer genome atlas,TCGA）與基因型-組織表達(dá)（the genotype-tissue expression,GTEx）數(shù)據(jù)庫(kù)共 9 736個(gè)腫瘤樣本、8 587個(gè)正常樣本的RNA測(cè)序（RNA sequencing,RNA-seq）表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。本研究使用GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證之前挖掘Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)所得出的相關(guān)結(jié)果，然后通過(guò)“Correlation Analysis”模塊分析ASF1B mRNA與肺腺癌發(fā)生關(guān)系密切的細(xì)胞周期調(diào)控因子表達(dá)的相關(guān)性，應(yīng)用“Survival Plots”模塊進(jìn)一步分析ASF1B mRNA與肺腺癌臨床分期及生存預(yù)后之間的關(guān)系。

1.3 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ualcan.path.uab.edu/）是一個(gè)有效的交互式的癌癥數(shù)據(jù)挖掘工具，可以執(zhí)行對(duì)TCGA基因表達(dá)數(shù)據(jù)的深入分析。本研究利用UALCAN對(duì)Oncomine和GEPIA2所得出的表達(dá)差異結(jié)果再次進(jìn)行驗(yàn)證，并初步探索ASF1B mRNA表達(dá)水平與TP53突變的相關(guān)性。

1.4 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background）基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus,GEO）、歐洲基因表型數(shù)據(jù)庫(kù)（European genomephenome archive,EGA）及TCGA等公共數(shù)據(jù)庫(kù)的基因芯片和RNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)建而成，評(píng)估了54 675個(gè)基因在21種癌癥中對(duì)于生存率的影響。本研究利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)觀察ASF1B mRNA表達(dá)與肺腺癌患者總生存率（overall survival,OS）和首次進(jìn)展生存率（first progression,FP）的關(guān)系。

1.5 Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)分析 Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.linkedomics.org/login.php）包含來(lái)自 TCGA、臨床蛋白質(zhì)組腫瘤分析協(xié)作組（clinical proteomic tumor analysis consortium，CPTAC）等多平臺(tái)32種癌癥類(lèi)型的多組學(xué)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。本研究利用Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)分析ASF1B mRNA與肺腺癌患者臨床資料的相關(guān)性，采用Pearson相關(guān)篩選與ASF1B具有正負(fù)相關(guān)性的共表達(dá)基因，將相關(guān)性最高的前50個(gè)基因生成在線熱圖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用數(shù)據(jù)庫(kù)自帶模塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。肺腺癌組織與正常肺組織中ASF1B基因表達(dá)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不同臨床分期ASF1B基因表達(dá)比較采用單因素方差分析；采用Pearson相關(guān)分析ASF1B基因表達(dá)與細(xì)胞周期調(diào)控因子表達(dá)的相關(guān)性；利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析ASF1B基因與肺腺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASF1B mRNA在不同類(lèi)型腫瘤中的表達(dá)情況 按照設(shè)置的檢索條件，Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集401項(xiàng)ASF1B mRNA在不同類(lèi)型腫瘤組織與正常組織中表達(dá)比較的研究。ASF1B mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的研究結(jié)果共47項(xiàng)，其中ASF1B mRNA表達(dá)增高的研究有44項(xiàng)，表達(dá)降低的研究只有3項(xiàng)。有8項(xiàng)肺癌相關(guān)的研究表明ASF1B mRNA表達(dá)升高。同樣，在GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索ASF1B在常見(jiàn)腫瘤類(lèi)型中的表達(dá)情況，結(jié)果與Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)類(lèi)似（圖1，見(jiàn)插頁(yè)）。

圖1 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）mRNA在不同類(lèi)型腫瘤中的表達(dá)情況[a：Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)；b：基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（GEPIA2）數(shù)據(jù)庫(kù)]

2.2 ASF1B在肺腺癌組織中的表達(dá)情況 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析ASF1B在肺腺癌中的表達(dá)情況，其中4個(gè)數(shù)據(jù)集中，肺腺癌組織中ASF1B mRNA表達(dá)水平均高于正常肺組織（均P＜0.05）。通過(guò)GEPIA2和UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中ASF1B mRNA表達(dá)水平均高于正常肺組織（均P＜0.05），見(jiàn)圖 2。

圖2 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）在正常肺組織和肺腺癌組織中的表達(dá)情況[a-d：Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)；e：UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)；f：基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（GEPIA2）數(shù)據(jù)庫(kù)；*P＜0.05]

2.3 ASF1B mRNA表達(dá)水平與肺腺癌TNM臨床分期的關(guān)系 在GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)中分析ASF1B mRNA表達(dá)與TNM臨床分期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同TNM臨床分期的肺腺癌患者ASF1B mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.14，P＜0.05），見(jiàn)圖 3。

圖3 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）表達(dá)水平與肺腺癌TNM臨床分期的關(guān)系

2.4 ASF1B mRNA表達(dá)水平與肺腺癌TP53突變的相關(guān)性 通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，正常肺組織中ASF1B mRNA表達(dá)水平均低于肺腺癌TP53突變組和無(wú)突變組（均P＜0.05），且肺腺癌TP53無(wú)突變組ASF1B mRNA表達(dá)水平低于突變組（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）mRNA表達(dá)水平與肺腺癌TP53突變的相關(guān)性（*P＜0.05）

2.5 肺腺癌ASF1B mRNA表達(dá)水平與細(xì)胞周期調(diào)控因子表達(dá)的相關(guān)性分析 應(yīng)用GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)性分析功能，對(duì)肺腺癌中ASF1B mRNA表達(dá)與細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（cyclindependent kinases，CDKs）的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，證實(shí)ASF1與上述絕大多數(shù)基因的表達(dá)呈正相關(guān)，見(jiàn)表1～2。

表1 肺腺癌ASF1BmRNA表達(dá)水平與Cyclins表達(dá)的相關(guān)性分析

2.6 ASF1B mRNA表達(dá)水平與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 檢索Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，ASF1B低表達(dá)組肺腺癌患者OS和FP均優(yōu)于ASF1B（均P＜0.05）。GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)也顯示，ASF1B低表達(dá)組肺腺癌患者OS和無(wú)病生存期均優(yōu)于ASF1B高表達(dá)組（均P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）mRNA與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系[a-b：Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)；c-d：基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（GEPIA2）數(shù)據(jù)庫(kù)]

2.7 肺腺癌組織中ASF1B的共表達(dá)基因分析 檢索Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Pearson相關(guān)篩選出與ASF1B具有正負(fù)相關(guān)性的共表達(dá)基因，并將相關(guān)性最高的前50個(gè)基因生成在線熱圖。結(jié)果表明 CDCA5、CDCA8、RAD54L等 50個(gè)基因與ASF1B在轉(zhuǎn)錄水平上呈正相關(guān)（均 P＜0.05），ZBTB4、CRY2、VAMP2 等 50個(gè)基因與ASF1B在轉(zhuǎn)錄水平上呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），初步探討了ASF1B參與肺腺癌進(jìn)程的潛在分子機(jī)制，為后續(xù)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)，見(jiàn)圖6（插頁(yè)）。

表2 肺腺癌ASF1B mRNA表達(dá)水平與CDKs表達(dá)的相關(guān)性

圖6 肺腺癌組織中抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）的共表達(dá)基因分析（a：正相關(guān)；b：負(fù)相關(guān)）

3 討論

ASF1具有調(diào)節(jié)染色質(zhì)功能，并已證明有助于腫瘤的發(fā)生[9]。ASF1包括ASF1A和ASF1B兩個(gè)主要的亞型。其中ASF1B主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，優(yōu)先參與細(xì)胞的增殖活動(dòng)，可能作為潛在的腫瘤靶標(biāo)參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]。

Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，ASF1B在宮頸癌細(xì)胞中起癌基因的作用。ASF1B的沉默抑制了體內(nèi)和體外宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)了細(xì)胞周期停滯，并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，而ASF1B的過(guò)表達(dá)則促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖。其主要機(jī)制是ASF1B與CDK9形成穩(wěn)定的復(fù)合物，并積極調(diào)節(jié)CDK9的穩(wěn)定性。本研究同樣分析了ASF1B與調(diào)控細(xì)胞周期的兩個(gè)重要相關(guān)因子Cyclins和CDKs之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ASF1B與多數(shù)相關(guān)因子的表達(dá)呈正相關(guān)，提示ASF1B可能在腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中起到重要作用，值得進(jìn)一步深入探討分析。Corpet等[6]研究表明，ASF1B在乳腺癌細(xì)胞中具有特異性增殖作用，這是ASF1A所無(wú)法比擬的。當(dāng)細(xì)胞周期結(jié)束時(shí)，與 ASF1B相對(duì)應(yīng)的mRNA和蛋白表達(dá)量均減少，并且ASF1B的缺失嚴(yán)重影響細(xì)胞增殖，導(dǎo)致異常的核結(jié)構(gòu)和明顯的異常轉(zhuǎn)錄特征。通過(guò)研究ASF1B表達(dá)水平與乳腺癌臨床預(yù)后的關(guān)系，證明了ASF1B是乳腺癌預(yù)后新的標(biāo)志物，可高度預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。筆者通過(guò)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)ASF1B高表達(dá)預(yù)示著肺腺癌患者的不良預(yù)后，提示ASF1B或許同樣可以作為肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立標(biāo)志基因，后期研究需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，驗(yàn)證該結(jié)論。Han等[11]發(fā)現(xiàn)沉默ASF1B可以抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡和細(xì)胞周期停滯，這種抑制作用可能與PI3K/Akt信號(hào)通路失活有關(guān)。這些結(jié)果均提示ASF1B有望作為腫瘤治療的分子靶點(diǎn)。

本研究首先通過(guò)Oncomine和GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)探索ASF1B mRNA在常見(jiàn)腫瘤中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，相較于癌旁組織，在大多數(shù)腫瘤組織中ASF1B mRNA表達(dá)水平都呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。進(jìn)一步從Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出4項(xiàng)數(shù)據(jù)集均提示ASF1B mRNA在肺腺癌中高表達(dá)。擴(kuò)大GEPIA2和UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析再次證實(shí)ASF1B mRNA的高表達(dá)，并且與患者的TNM臨床分期相關(guān)。TP53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類(lèi)腫瘤發(fā)生相關(guān)性最高的抑癌基因，有報(bào)道稱(chēng)甚至有50%以上的腫瘤患者存在TP53基因的突變[12]。本研究通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)肺腺癌TP53突變組ASF1B mRNA表達(dá)水平高于TP53無(wú)突變組，這一結(jié)論提示了ASF1B與TP53突變存在某種聯(lián)系，這對(duì)后續(xù)的研究提供了重要的參考意義。

綜上所述，ASF1B在肺腺癌組織中高表達(dá)，且與肺腺癌的進(jìn)展和預(yù)后有一定相關(guān)性，通過(guò)后續(xù)深入研究，或許能夠作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的新型分子標(biāo)志物和腫瘤治療的新靶點(diǎn)。本研究亦有不足之處，上述多個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)研究結(jié)果僅僅是在轉(zhuǎn)錄水平上得出的，具有一定局限性，有待在蛋白翻譯水平得到進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，ASF1B參與肺腺癌進(jìn)程的具體作用機(jī)制尚不明確，需要深入的基礎(chǔ)研究來(lái)闡明ASF1B的作用和調(diào)控機(jī)制，為臨床肺腺癌的治療及靶向藥物的研制提供扎實(shí)的理論依據(jù)。