王佶 楊崢 李海林

肺腺癌是肺癌最常見的組織學亞型，是人類因癌 癥死亡的主要原因之一[1]。盡管目前肺腺癌的治療手段較多，包括靶向治療、免疫治療等，但面對晚期肺腺癌，治療結(jié)果仍難以令人滿意。相較于肺鱗狀細胞癌，肺腺癌主要發(fā)生在末端細支氣管和肺泡內(nèi)，很難用支氣管鏡檢查[2]。因此，肺腺癌的早期階段更加難以識別，如何盡早診斷肺腺癌就顯得尤為重要。了解肺腺癌的潛在發(fā)病機制將為發(fā)現(xiàn)早期診斷性生物標志物提供新的見解，從而為肺腺癌患者提供個體化的治療策略。

抗沉默功能蛋白1（anti-silencing function 1,ASF1）最初在酵母中被發(fā)現(xiàn)，屬于組蛋白H3-H4伴侶蛋白[3]。ASF1在組蛋白的聚合、轉(zhuǎn)運、修飾等過程中發(fā)揮著重要的作用[4]。ASF1有2個主要的亞型，分別是ASF1A和ASF1B[5]。已有研究顯示ASF1B在乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌等腫瘤中異常表達，有望成為多種惡性腫瘤新的預后因子[6-8]。然而在肺腺癌中，ASF1B基因表達及其臨床意義尚不清楚。本研究基于生物信息學分析ASF1B基因在肺腺癌中的表達及其對預后的影響，初步探索ASF1B參與肺腺癌進程的潛在分子機制。

1 材料和方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析 Oncomine數(shù)據(jù)庫（https://www.oncomine.org/resource/login.html）的一項重要功能就是進行腫瘤組織和癌旁正常組織的基因表達差異分析。本研究設(shè)置的檢索條件如下：（1）Gene：ASF1B；（2）Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis；（3）Date Type：mRNA；（4）臨界值設(shè)定條件（P＜0.0001，fold change 2，gene rank=Top10%）。

1.2 基因表達譜動態(tài)分析（gene expression profiling interactive analysis,GEPIA2）數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA2數(shù)據(jù)庫（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）是北京大學張澤民教授實驗室開發(fā)的一個網(wǎng)站，能夠?qū)δ[瘤基因圖譜（the cancer genome atlas,TCGA）與基因型-組織表達（the genotype-tissue expression,GTEx）數(shù)據(jù)庫共 9 736個腫瘤樣本、8 587個正常樣本的RNA測序（RNA sequencing,RNA-seq）表達數(shù)據(jù)進行分析。本研究使用GEPIA2數(shù)據(jù)庫驗證之前挖掘Oncomine數(shù)據(jù)庫所得出的相關(guān)結(jié)果，然后通過“Correlation Analysis”模塊分析ASF1B mRNA與肺腺癌發(fā)生關(guān)系密切的細胞周期調(diào)控因子表達的相關(guān)性，應用“Survival Plots”模塊進一步分析ASF1B mRNA與肺腺癌臨床分期及生存預后之間的關(guān)系。

1.3 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析 UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/）是一個有效的交互式的癌癥數(shù)據(jù)挖掘工具，可以執(zhí)行對TCGA基因表達數(shù)據(jù)的深入分析。本研究利用UALCAN對Oncomine和GEPIA2所得出的表達差異結(jié)果再次進行驗證，并初步探索ASF1B mRNA表達水平與TP53突變的相關(guān)性。

1.4 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background）基于基因表達數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus,GEO）、歐洲基因表型數(shù)據(jù)庫（European genomephenome archive,EGA）及TCGA等公共數(shù)據(jù)庫的基因芯片和RNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)建而成，評估了54 675個基因在21種癌癥中對于生存率的影響。本研究利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫觀察ASF1B mRNA表達與肺腺癌患者總生存率（overall survival,OS）和首次進展生存率（first progression,FP）的關(guān)系。

1.5 Linked Omics數(shù)據(jù)庫分析 Linked Omics數(shù)據(jù)庫（http://www.linkedomics.org/login.php）包含來自 TCGA、臨床蛋白質(zhì)組腫瘤分析協(xié)作組（clinical proteomic tumor analysis consortium，CPTAC）等多平臺32種癌癥類型的多組學數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。本研究利用Linked Omics數(shù)據(jù)庫分析ASF1B mRNA與肺腺癌患者臨床資料的相關(guān)性，采用Pearson相關(guān)篩選與ASF1B具有正負相關(guān)性的共表達基因，將相關(guān)性最高的前50個基因生成在線熱圖。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用數(shù)據(jù)庫自帶模塊進行統(tǒng)計分析。肺腺癌組織與正常肺組織中ASF1B基因表達的比較采用兩獨立樣本t檢驗；不同臨床分期ASF1B基因表達比較采用單因素方差分析；采用Pearson相關(guān)分析ASF1B基因表達與細胞周期調(diào)控因子表達的相關(guān)性；利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析ASF1B基因與肺腺癌患者預后之間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ASF1B mRNA在不同類型腫瘤中的表達情況 按照設(shè)置的檢索條件，Oncomine數(shù)據(jù)庫中共收集401項ASF1B mRNA在不同類型腫瘤組織與正常組織中表達比較的研究。ASF1B mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義的研究結(jié)果共47項，其中ASF1B mRNA表達增高的研究有44項，表達降低的研究只有3項。有8項肺癌相關(guān)的研究表明ASF1B mRNA表達升高。同樣，在GEPIA2數(shù)據(jù)庫中檢索ASF1B在常見腫瘤類型中的表達情況，結(jié)果與Oncomine數(shù)據(jù)庫類似（圖1，見插頁）。

圖1 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）mRNA在不同類型腫瘤中的表達情況[a：Oncomine數(shù)據(jù)庫；b：基因表達譜動態(tài)分析（GEPIA2）數(shù)據(jù)庫]

2.2 ASF1B在肺腺癌組織中的表達情況 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫進一步分析ASF1B在肺腺癌中的表達情況，其中4個數(shù)據(jù)集中，肺腺癌組織中ASF1B mRNA表達水平均高于正常肺組織（均P＜0.05）。通過GEPIA2和UALCAN數(shù)據(jù)庫進一步驗證，發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中ASF1B mRNA表達水平均高于正常肺組織（均P＜0.05），見圖 2。

圖2 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）在正常肺組織和肺腺癌組織中的表達情況[a-d：Oncomine數(shù)據(jù)庫；e：UALCAN數(shù)據(jù)庫；f：基因表達譜動態(tài)分析（GEPIA2）數(shù)據(jù)庫；*P＜0.05]

2.3 ASF1B mRNA表達水平與肺腺癌TNM臨床分期的關(guān)系 在GEPIA2數(shù)據(jù)庫中分析ASF1B mRNA表達與TNM臨床分期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同TNM臨床分期的肺腺癌患者ASF1B mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義（F=3.14，P＜0.05），見圖 3。

圖3 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）表達水平與肺腺癌TNM臨床分期的關(guān)系

2.4 ASF1B mRNA表達水平與肺腺癌TP53突變的相關(guān)性 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，正常肺組織中ASF1B mRNA表達水平均低于肺腺癌TP53突變組和無突變組（均P＜0.05），且肺腺癌TP53無突變組ASF1B mRNA表達水平低于突變組（P＜0.05），見圖4。

圖4 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）mRNA表達水平與肺腺癌TP53突變的相關(guān)性（*P＜0.05）

2.5 肺腺癌ASF1B mRNA表達水平與細胞周期調(diào)控因子表達的相關(guān)性分析 應用GEPIA2數(shù)據(jù)庫中相關(guān)性分析功能，對肺腺癌中ASF1B mRNA表達與細胞周期蛋白（Cyclins）和細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinases，CDKs）的表達進行相關(guān)性分析，證實ASF1與上述絕大多數(shù)基因的表達呈正相關(guān)，見表1～2。

表1 肺腺癌ASF1BmRNA表達水平與Cyclins表達的相關(guān)性分析

2.6 ASF1B mRNA表達水平與肺腺癌患者預后的關(guān)系 檢索Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，ASF1B低表達組肺腺癌患者OS和FP均優(yōu)于ASF1B（均P＜0.05）。GEPIA2數(shù)據(jù)庫也顯示，ASF1B低表達組肺腺癌患者OS和無病生存期均優(yōu)于ASF1B高表達組（均P＜0.05），見圖5。

圖5 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）mRNA與肺腺癌患者預后的關(guān)系[a-b：Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫；c-d：基因表達譜動態(tài)分析（GEPIA2）數(shù)據(jù)庫]

2.7 肺腺癌組織中ASF1B的共表達基因分析 檢索Linked Omics數(shù)據(jù)庫，采用Pearson相關(guān)篩選出與ASF1B具有正負相關(guān)性的共表達基因，并將相關(guān)性最高的前50個基因生成在線熱圖。結(jié)果表明 CDCA5、CDCA8、RAD54L等 50個基因與ASF1B在轉(zhuǎn)錄水平上呈正相關(guān)（均 P＜0.05），ZBTB4、CRY2、VAMP2 等 50個基因與ASF1B在轉(zhuǎn)錄水平上呈負相關(guān)（均P＜0.05），初步探討了ASF1B參與肺腺癌進程的潛在分子機制，為后續(xù)的進一步研究奠定了基礎(chǔ)，見圖6（插頁）。

表2 肺腺癌ASF1B mRNA表達水平與CDKs表達的相關(guān)性

圖6 肺腺癌組織中抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）的共表達基因分析（a：正相關(guān)；b：負相關(guān)）

3 討論

ASF1具有調(diào)節(jié)染色質(zhì)功能，并已證明有助于腫瘤的發(fā)生[9]。ASF1包括ASF1A和ASF1B兩個主要的亞型。其中ASF1B主要定位于細胞核內(nèi)，優(yōu)先參與細胞的增殖活動，可能作為潛在的腫瘤靶標參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]。

Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，ASF1B在宮頸癌細胞中起癌基因的作用。ASF1B的沉默抑制了體內(nèi)和體外宮頸癌細胞的生長，誘導了細胞周期停滯，并促進了細胞凋亡，而ASF1B的過表達則促進了癌細胞的增殖。其主要機制是ASF1B與CDK9形成穩(wěn)定的復合物，并積極調(diào)節(jié)CDK9的穩(wěn)定性。本研究同樣分析了ASF1B與調(diào)控細胞周期的兩個重要相關(guān)因子Cyclins和CDKs之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ASF1B與多數(shù)相關(guān)因子的表達呈正相關(guān)，提示ASF1B可能在腫瘤細胞增殖過程中起到重要作用，值得進一步深入探討分析。Corpet等[6]研究表明，ASF1B在乳腺癌細胞中具有特異性增殖作用，這是ASF1A所無法比擬的。當細胞周期結(jié)束時，與 ASF1B相對應的mRNA和蛋白表達量均減少，并且ASF1B的缺失嚴重影響細胞增殖，導致異常的核結(jié)構(gòu)和明顯的異常轉(zhuǎn)錄特征。通過研究ASF1B表達水平與乳腺癌臨床預后的關(guān)系，證明了ASF1B是乳腺癌預后新的標志物，可高度預測轉(zhuǎn)移的發(fā)生。筆者通過多個數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)ASF1B高表達預示著肺腺癌患者的不良預后，提示ASF1B或許同樣可以作為肺腺癌患者預后的獨立標志基因，后期研究需進一步擴大樣本量，驗證該結(jié)論。Han等[11]發(fā)現(xiàn)沉默ASF1B可以抑制前列腺癌細胞的增殖，并促進其凋亡和細胞周期停滯，這種抑制作用可能與PI3K/Akt信號通路失活有關(guān)。這些結(jié)果均提示ASF1B有望作為腫瘤治療的分子靶點。

本研究首先通過Oncomine和GEPIA2數(shù)據(jù)庫探索ASF1B mRNA在常見腫瘤中的表達情況，結(jié)果顯示，相較于癌旁組織，在大多數(shù)腫瘤組織中ASF1B mRNA表達水平都呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。進一步從Oncomine數(shù)據(jù)庫中篩選出4項數(shù)據(jù)集均提示ASF1B mRNA在肺腺癌中高表達。擴大GEPIA2和UALCAN數(shù)據(jù)庫分析再次證實ASF1B mRNA的高表達，并且與患者的TNM臨床分期相關(guān)。TP53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤發(fā)生相關(guān)性最高的抑癌基因，有報道稱甚至有50%以上的腫瘤患者存在TP53基因的突變[12]。本研究通過UALCAN數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)肺腺癌TP53突變組ASF1B mRNA表達水平高于TP53無突變組，這一結(jié)論提示了ASF1B與TP53突變存在某種聯(lián)系，這對后續(xù)的研究提供了重要的參考意義。

綜上所述，ASF1B在肺腺癌組織中高表達，且與肺腺癌的進展和預后有一定相關(guān)性，通過后續(xù)深入研究，或許能夠作為預測患者預后的新型分子標志物和腫瘤治療的新靶點。本研究亦有不足之處，上述多個在線數(shù)據(jù)庫研究結(jié)果僅僅是在轉(zhuǎn)錄水平上得出的，具有一定局限性，有待在蛋白翻譯水平得到進一步驗證。此外，ASF1B參與肺腺癌進程的具體作用機制尚不明確，需要深入的基礎(chǔ)研究來闡明ASF1B的作用和調(diào)控機制，為臨床肺腺癌的治療及靶向藥物的研制提供扎實的理論依據(jù)。