余柯達 毛佳婷 柴娟 包云 高輝 師帥

不孕不育癥已成為一種常見疾病，在我國已婚夫婦中的比列約為10%，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。輔助生殖技術是治療不育不孕癥主要的技術手段，體外受精（in vitro fertilization,IVF）實驗室是輔助生殖技術中最重要的組成部分，是人類配子和胚胎體外培養(yǎng)的場所。人類配子和胚胎在體外對環(huán)境非常敏感，因此對新建IVF實驗室整個培養(yǎng)系統(tǒng)進行質(zhì)控評估，是進行輔助生殖技術治療前的必要程序[2]。目前鼠胚實驗（mouse embryo assay，MEA）已應用于 IVF領域的試劑、耗材和儀器設備的質(zhì)量控制，以及新建或新啟動IVF實驗室的質(zhì)量控制[3]。金華市人民醫(yī)院IVF實驗室于2020年初建成，經(jīng)過前期潔凈消毒和“熱處理”[4]后，自2021年4至5月采用MEA檢測實驗室的培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)體系是否符合輔助生殖技術人類胚胎體外培養(yǎng)的要求，并探討不同培養(yǎng)環(huán)境（O2濃度）對小鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響，為開展人類胚胎體外培養(yǎng)提供可靠的實驗依據(jù)及質(zhì)量保障，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級4～8周齡雌性ICR小鼠100只、8周齡以上雄性ICR小鼠20只，均購自金華市實驗動物中心，在恒溫（25℃）環(huán)境下飼養(yǎng)，12 h光照12 h黑暗環(huán)境，正常晝夜節(jié)律自由飲食，喂養(yǎng)1周后用于實驗。動物實驗內(nèi)容及操作均獲金華市食品藥品檢驗檢測研究院實驗動物倫理委員會批準（批準編號：AL-JSYJ202199）。

1.2 試劑與設備 孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin,PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,hCG）均購自寧波第二激素廠；取卵-胚胎處理液G-MOPS PLUS、洗精受精液G-IVF PLUS、卵裂胚培養(yǎng)液G-1 PLUS、囊胚培養(yǎng)液G-2 PLUS、石蠟油均購自瑞典Vitrolife公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（二氣，日本SANYO公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（三氣，日本 ASTEC公司）；解剖顯微鏡（日本NIKON公司）；倒置顯微鏡（日本 OLYMPUS公司）；HARIOMED IVF工作站（中國華粵行儀器有限公司）等。

1.3 小鼠超排卵 用0.9%氯化鈉溶液將PMSG和hCG分別配制成100 U/ml的溶液，分裝保存于-80℃。于17∶00雌鼠腹腔內(nèi)注射PMSG 10 U/只，48 h后再腹腔內(nèi)注射hCG 10 U/只。根據(jù)受精方式將雌鼠分為體內(nèi)受精組和IVF組。

1.4 體內(nèi)受精組 注射hCG后將50只雌鼠和雄鼠按1∶1合籠，次日8∶00觀察雌鼠陰道栓形成情況，分3批進行。將形成陰道栓的雌鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下取出卵巢和輸卵管，在G-MOPS PLUS中洗滌3遍，在解剖顯微鏡下用1 ml注射器刺破輸卵管膨大部位使合子團（顆粒細胞包裹的原核胚）自動溢出，吸取合子團置于透明質(zhì)酸酶中去除顆粒細胞，觀察原核胚的形成情況后進行微滴培養(yǎng)。

1.5 IVF組

1.5.1 卵母細胞的采集 注射hCG后次日8∶00頸椎脫臼處死50只未合籠的雌鼠，無菌條件下取出卵巢和輸卵管，在G-MOPS PLUS中洗滌3遍，在解剖顯微鏡下用1 ml注射器刺破輸卵管膨大部位使卵子團（顆粒細胞包裹的卵子）自動溢出，吸取卵子團置于G-IVF PLUS中。

1.5.2 精子的采集與處理 將上述20只雄鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下取出附睪及部分輸精管在GMOPS PLUS中洗滌3遍，放入G-IVF PLUS液滴中，在解剖顯微鏡下用1 ml注射器刺破附睪，使精子游出，將含有精子的G-IVF PLUS液滴加入裝有G-IVF PLUS的試管底部，上游法處理30～60 min，活動力好的精子均游到G-IVF PLUS的上層液體中。

1.5.3 IVF與培養(yǎng) 收集獲能后G-IVF PLUS上層液體中的精子，觀察其活力，并用精子計數(shù)板計算濃度，取適量含精子的G-IVF PLUS加入含有卵子團的GIVF PLUS中，使精子終濃度約為1×106/ml，受精4～6 h后觀察原核。

1.6 不同O2濃度下培養(yǎng) 將體內(nèi)受精組所獲得的原核胚分別放入二氣（37℃，6% CO2，大氣O2濃度）和三氣（37 ℃，6% CO2，5% O2）CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。IVF組則是將加入精子懸液后的卵子團分別放入二氣和三氣CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，觀察原核后將原核胚再次放回對應CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 原核及早期胚胎的觀察與培養(yǎng) 倒置顯微鏡下觀察原核及早期胚胎培養(yǎng)情況。當天（D0）：原核觀察，轉移至G-1 PLUS微滴中培養(yǎng)；D1：2細胞期胚胎觀察；D2：4細胞期胚胎觀察；D3：8細胞期或桑椹期胚胎觀察，并轉移至G-2 PLUS微滴中培養(yǎng)；D4：囊胚觀察；D5：孵化期囊胚觀察。

1.8 受精率、卵裂率和囊胚形成率計算 受精率=受精卵數(shù)/獲卵數(shù)×100%，卵裂率=2細胞胚胎數(shù)/受精卵數(shù)×100%，囊胚形成率=囊胚數(shù)/2細胞胚胎數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠胚胎的體外培養(yǎng)觀察情況 卵子團為顆粒細胞包裹的卵子（圖1a，見插頁）；D0可見受精卵內(nèi)雙原核及雙極體（圖1b，見插頁）；D1可見受精卵分裂為2個大小均勻的卵裂球，為2細胞期胚胎（圖1c，見插頁）；D2可見4個大小均勻的卵裂球，為4細胞期胚胎（圖1d，見插頁）；D3可見8個大小均勻的卵裂球，為8細胞期胚胎（圖1e，見插頁），或為卵裂球互相融合的桑椹期胚胎（圖1f，見插頁）；D4可見胚胎進入早期囊胚或擴張期囊胚階段（圖1g，見插頁）；D5可見囊胚的一部分或全部從透明帶中逸出，為孵化期囊胚（圖1h，見插頁）。

圖1 小鼠的卵子團和胚胎發(fā)育情況（a：卵子團；b：受精卵；c：2細胞期胚胎；d：4細胞期胚胎；e：8細胞期胚胎；f：桑椹期胚胎；g：早期囊胚及擴張期囊胚；h：孵化期囊胚；×200）

2.2 體內(nèi)受精組和IVF組胚胎發(fā)育情況比較 體內(nèi)受精組和IVF組各處理了50只雌鼠。體內(nèi)受精組共獲卵1 387個，受精率、卵裂率和囊胚形成率分別為86.37%、94.74%和91.72%；IVF組共獲卵1 345個，受精率、卵裂率和囊胚形成率分別為80.67%、94.75%和91.05%。體內(nèi)受精組的受精率明顯高于IVF組（P＜0.05），但兩組卵裂率和囊胚形成率比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表 1。

表1 小鼠體內(nèi)受精組和IVF組胚胎發(fā)育情況比較

2.3 不同O2濃度對小鼠胚胎發(fā)育的影響 體內(nèi)受精組中，二氣培養(yǎng)環(huán)境下，受精率、卵裂率和囊胚形成率分別為87.04%、93.09%和88.19%；三氣培養(yǎng)環(huán)境下，受精率、卵裂率和囊胚形成率分別為85.79%、96.21%和94.75%。二氣培養(yǎng)與三氣培養(yǎng)受精率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但二氣培養(yǎng)卵裂率和囊胚形成率均低于三氣培養(yǎng)（均P＜0.05）。IVF組中，二氣和三氣培養(yǎng)環(huán)境下的鼠胚發(fā)育情況與體內(nèi)受精組類似，二氣培養(yǎng)與三氣培養(yǎng)受精率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但二氣培養(yǎng)卵裂率和囊胚形成率均低于三氣培養(yǎng)（均 P＜0.01），見表 2。

表2 不同O2濃度對小鼠胚胎發(fā)育的影響

3 討論

健康的單胎活產(chǎn)是IVF的目標，這一目標的實現(xiàn)在一定程度上取決于良好的培養(yǎng)環(huán)境，即IVF實驗室，其能夠支持實現(xiàn)具有植入潛能的健康胚胎的發(fā)育[5]。良好的IVF實驗室培養(yǎng)環(huán)境評估需要進行質(zhì)量控制，MEA是新建或新啟動IVF實驗室最廣泛應用的質(zhì)量控制方法[2，6-8]，其可以有效檢測空氣質(zhì)量、溫濕度、耗材、培養(yǎng)試劑、培養(yǎng)箱和實驗人員的技術水平等[9]。

本研究利用ICR小鼠進行體內(nèi)受精和IVF實驗，結果表明體內(nèi)受精組的受精率為86.37%，高于IVF組的80.67%，原因可能是體內(nèi)受精的受精過程是在無光、恒溫、恒濕、低氧的小鼠輸卵管內(nèi)進行的，而IVF則受到體外環(huán)境（溫濕度、滲透壓、pH等）的影響[10]；體內(nèi)受精組和IVF組的囊胚形成率達91.72%和91.05%，均大于輔助生殖技術實驗室質(zhì)量控制標準的80%，且超過近幾年國內(nèi)文獻報道的囊胚形成率[2，6-7]。表明本院生殖醫(yī)學中心新建的IVF實驗室的培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)體系和實驗室人員的技術水平已達到標準，能夠開展人類輔助生殖技術。

早期胚胎在體外培養(yǎng)過程中，O2濃度會影響其發(fā)育的速度和質(zhì)量，其是調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的重要生理因素。目前國內(nèi)外IVF實驗室進行早期胚胎體外培養(yǎng)時培養(yǎng)箱中的O2濃度5%和20%均存在[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的體內(nèi)受精組和IVF組中，二氣培養(yǎng)（大氣O2濃度，約20%）和三氣培養(yǎng)（5% O2）的受精率比較差異無統(tǒng)計學意義，但二氣培養(yǎng)的卵裂率和囊胚形成率均低于三氣培養(yǎng)，表明三氣培養(yǎng)更有利于小鼠早期胚胎的發(fā)育。這一結果與高亞可等[12]和Ciray等[13]的研究結果一致。

最早進行IVF治療時，早期胚胎體外培養(yǎng)是在大氣O2濃度（約20%）下進行的，數(shù)百萬健康嬰兒的出生證明了這種方法的有效性[14]。然而，目前許多研究表明在大氣O2濃度下，胚胎在體外培養(yǎng)過程中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的增加會導致氧化應激，會使哺乳動物的胚胎在體外培養(yǎng)過程中發(fā)育受損[15-17]。在胚胎發(fā)育早期階段DNA復制活躍，ROS會導致細胞中DNA斷裂及不可逆的雙鏈斷裂，從而導致胚胎不均勻分裂、延遲分裂和發(fā)育停滯等情況發(fā)生[18]。哺乳動物母體輸卵管環(huán)境中生理O2濃度約為5%，大部分研究表明低氧環(huán)境可有效促進哺乳動物胚胎的發(fā)育和提高囊胚的質(zhì)量[12，19]。而本研究中O2濃度對受精率無影響的可能原因是受精過程中大氣O2濃度下并未產(chǎn)生過量的ROS，或者是配子與胚胎的自我修復機制抵消了這部分影響[20]。

綜上所述，MEA的體內(nèi)受精和IVF均可有效評估新建或新啟動IVF實驗室的培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)體系的可靠性，本研究MEA的囊胚形成率達到了IVF實驗室的質(zhì)控標準。目前輔助生殖技術實驗室質(zhì)控標準統(tǒng)計的是體內(nèi)受精的1細胞期或2細胞期胚胎形成囊胚的比例，但其無法評價配子和受精卵對培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)體系的敏感性，且不能對實驗室人員的IVF技術水平進行全面評價，因此本研究建議進行培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)體系質(zhì)控時，除了關注囊胚形成率，還應結合IVF的受精情況。目前新建實驗室IVF的受精率均在80%以上[2，6-7，12]，因此建議 MEA IVF 的受精率應達 80%。對于IVF實驗室進行早期胚胎體外培養(yǎng)的氣體環(huán)境的選擇，本研究建議選用三氣培養(yǎng)（5% O2），其可有效減少ROS對早期胚胎的氧化應激作用，并可提高其發(fā)育潛能。