于輝 陳輝

慢性盆腔炎是女性上生殖道感染性疾病，表現(xiàn)為子宮、陰道及周?chē)Y(jié)締組織炎癥，具有遷延難愈、反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，甚至可引發(fā)慢性盆腔痛、異位妊娠、不孕等[1-2]。目前，臨床上對(duì)于慢性盆腔炎主要采取抗菌藥物、激素等藥物治療或物理療法，但療效并不理想，并且長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用抗菌藥物易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥、多重感染等諸多弊端，增加治療難度[3]。

NF-κB/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）/Smad 信號(hào)通路在機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4]。傳統(tǒng)中藥白芍為毛茛科植物芍藥的干燥根，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛的功效，常用于月經(jīng)不調(diào)、盜汗、腹痛等癥的治療。白芍總苷（total glucosides of paeony,TGP）是中藥白芍的主要活性成分，具有良好的抗炎活性[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，TGP對(duì)NF-κB/TGF-β1/Smad信號(hào)通路具有調(diào)控作用[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備慢性盆腔炎大鼠模型，以婦科千金片為陽(yáng)性對(duì)照藥物，探討TGP對(duì)慢性盆腔炎大鼠子宮的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康成年雌性未孕SD大鼠120只，體質(zhì)量200～240 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（冀）2018-004。分籠飼養(yǎng)于河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫25℃，相對(duì)濕度55%～65%，12 h光照黑暗交替，自由飲水進(jìn)食，無(wú)菌通風(fēng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑與儀器 TGP膠囊（批號(hào)：20191124）購(gòu)自寧波立華制藥有限公司；婦科千金片（批號(hào)：B190030407）購(gòu)自株洲千金藥業(yè)股份有限公司；HE染色試劑盒（批號(hào)：200115）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-1β、IL-10 ELISA 試劑盒（批號(hào)：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0006）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；NF-κB、TGF-β1、Smad 同源物 2（Smad2）、Smad同源物 3（Smad3）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體和IgG 二抗（批號(hào)：bs-23217R、bs-0086R、bs-0718R、bs-3484R、bs-0061R、bs-0295G）購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司；3×1010混合細(xì)菌懸液（鏈球菌∶大腸埃希菌∶金黃色葡萄糖球菌以1∶2∶1比例混合）由河北醫(yī)科大學(xué)生化教研室提供；RM2016型組織切片機(jī)購(gòu)自上海徠卡儀器有限公司；BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)購(gòu)自常州郊區(qū)中威電子儀器廠；Spectra Max3型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecuar Devices公司；VE180型小型高通量電泳槽購(gòu)自上海天能科技有限公司；SE300型電泳儀、TE22型轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Hoefer公司；DHG-9140A型烘烤箱購(gòu)自上?；厶﹥x器制造有限公司；X-70型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組、模型制備與給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將120只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、婦科千金片組（150 mg/kg）[7]和 TGP 低、中、高劑量組（20、40、80 mg/kg）6組，每組20只。參照秦翠梅等[8]報(bào)道的方法制備慢性盆腔炎大鼠模型：實(shí)施麻醉后仰臥位固定，沿下腹部中線(xiàn)切口（長(zhǎng)度約1 cm），暴露子宮，用1 ml無(wú)菌注射器針頭于子宮分叉處刺入子宮，連續(xù)來(lái)回抽推針頭3次造成機(jī)械損傷，然后以0.2 ml劑量注入混合細(xì)菌懸液，然后逐層縫合，碘伏消毒；假手術(shù)組大鼠僅子宮注射0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液（不來(lái)回抽推針頭，不造成機(jī)械損傷）。造模10 d后，TGP低、中、高劑量組分別給予濃度 4、8、16 g/L 的 TGP 溶液（5 ml/kg）灌胃，婦科千金片組給予濃度30 g/L的婦科千金片溶液（5 ml/kg）灌胃，假手術(shù)組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液（5 ml/kg）灌胃，各組均1次/d、療程21 d。

1.3.2 子宮大體情況觀察及子宮粘連評(píng)分 末次給藥24 h后，各組分別隨機(jī)取10只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，開(kāi)腹取子宮組織，觀察子宮大體情況。通過(guò)Verco評(píng)分評(píng)價(jià)子宮粘連狀況[9]：無(wú)粘連計(jì)0分；輕微膜狀粘連計(jì)1分；子宮角與腸管或膀胱粘連，根據(jù)粘連致密程度計(jì)2～3分；嚴(yán)重粘連、子宮固定不動(dòng)計(jì)4分。

1.3.3 子宮系數(shù)計(jì)算 大鼠稱(chēng)重后摘取子宮組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后稱(chēng)量子宮重量，子宮系數(shù)=子宮重量/大鼠體重。

1.3.4 子宮組織病理學(xué)檢查及病理評(píng)分 將子宮組織置4%多聚甲醛溶液固定3 d，經(jīng)石蠟浸潤(rùn)包埋、切片（厚度4 μm）、透明和脫蠟水化后行常規(guī)HE染色，中性樹(shù)膠封片后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察子宮組織病理學(xué)變化。分別從宮腔擴(kuò)張或粘連、上皮變性壞死、慢性炎癥浸潤(rùn)、內(nèi)膜充血水腫和上皮細(xì)胞增生5個(gè)方面進(jìn)行病理評(píng)分[10]，根據(jù)病變程度分別計(jì)0～3分。

1.3.5 血清炎癥因子水平檢測(cè) 末次給藥24 h后，分別取各組剩余10只大鼠，麻醉后開(kāi)腹，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min離心5 min后取血清，遵照ELISA試劑盒操作方法，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平。

1.3.6 子宮組織 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法?！?.3.5”步驟取血完成后，頸椎脫臼處死大鼠，取每只大鼠子宮組織100 mg，0.9%氯化鈉溶液沖洗后加入適量4℃冷裂解液，冰上靜置30 min，通過(guò)蛋白提取試劑盒提取子宮組織總蛋白，12 000 r/min離心15 min后取上清液，BCA法檢測(cè)總蛋白含量，100℃變性10 min，90 V恒壓電泳分離蛋白后300 mA恒流將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，8%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，滴加目標(biāo)蛋白NF-κB（1∶800）、TGF-β1（1∶800）、Smad2（1 ∶1 000）、Smad3（1∶1 000）和 β-actin（1∶2 000）一抗后 4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后滴加 IgG二抗（1∶3 000）后室溫孵育2 h，滴加ECL顯影后，通過(guò)Image J軟件分析條帶的灰度值，然后以β-actin為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，方差齊時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，多組間比較采用 Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用 Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮大體狀況觀察及子宮粘連評(píng)分比較 假手術(shù)組大鼠子宮顏色正常，未見(jiàn)充血水腫及周?chē)M織粘連；模型組大鼠子宮呈灰白色，充血水腫明顯，柔韌度和彈性降低，與周?chē)M織粘連嚴(yán)重，活動(dòng)度變差，質(zhì)地硬；與模型組比較，TGP低、中、高劑量組和婦科千金片組大鼠子宮充血水腫、柔韌度降低、與周?chē)M織粘連等呈不同程度改善，其中TGP高劑量組和婦科千金片組子宮顏色接近正常，輕微充血水腫，少量膜性粘連，效果優(yōu)于TGP低、中劑量組，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Verco評(píng)分升高（P＜0.01）；與模型組比較，TGP中、高劑量組和婦科千金片組Verco評(píng)分均降低（均P＜0.01）；TGP高劑量組與婦科千金片組Verco評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠子宮子宮粘連評(píng)分比較（分）

圖1 各組大鼠子宮大體狀況觀察[a：假手術(shù)組；b：模型組；c：婦科千金片組；d：白芍總苷（TGP）低劑量組；e：TGP中劑量組；f：TGP高劑量組]

2.2 各組大鼠子宮系數(shù)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮系數(shù)升高（P＜0.01）；與模型組比較，TGP中、高劑量組和婦科千金片組大鼠子宮系數(shù)均降低（均P＜0.01）；與婦科千金片組比較，TGP高劑量組大鼠子宮系數(shù)降低（P＜0.01），見(jiàn)表 2。

表2 各組大鼠子宮系數(shù)比較

2.3 各組大鼠子宮組織病理學(xué)改變及病理評(píng)分比較 假手術(shù)組大鼠子宮組織結(jié)構(gòu)清晰，肌纖維排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠子宮呈現(xiàn)上皮細(xì)胞增生，肌纖維紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體數(shù)量減少等病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；與模型組比較，TGP低、中、高劑量組和婦科千金片組子宮病變呈不同程度改善，其中TGP高劑量組效果最為顯著，見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮宮腔擴(kuò)張或粘連、上皮變性壞死、慢性炎癥浸潤(rùn)、內(nèi)膜充血水腫、上皮細(xì)胞增生5方面評(píng)分均升高（均P＜0.01）；與模型組比較，TGP中、高劑量組和婦科千金片組上述5方面評(píng)分均降低（均P＜0.01）；與婦科千金片組比較，TGP高劑量組上皮變性壞死、慢性炎癥浸潤(rùn)評(píng)分均降低（均P＜0.01），但兩組宮腔擴(kuò)張或粘連、內(nèi)膜充血水腫、上皮細(xì)胞增生評(píng)分比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0.05），見(jiàn)表 3。

表3 各組大鼠子宮組織病理評(píng)分比較（分）

圖2 各組大鼠子宮組織病理學(xué)檢查所見(jiàn)[a：假手術(shù)組；b：模型組；c：婦科千金片組；d：白芍總苷（TGP）低劑量組；e：TGP中劑量組；f：TGP 高劑量組；HE 染色，×200]

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均升高且IL-10水平降低（均P＜0.01）；與模型組比較，TGP中、高劑量組和婦科千金片組TNF-α、IL-1β水平均降低且IL-10水平均升高（均P＜0.05）；與婦科千金片組比較，TGP高劑量組TNF-α水平降低且IL-10水平升高（均P＜0.05），但TGP高劑量組與婦科千金片組IL-1β水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平比較

2.5 各組 大 鼠 子 宮 組 織 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表達(dá)水平均上調(diào)（均P＜0.01）；與模型組比較，TGP中、高劑量組 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3 表達(dá)水平均下調(diào)（均P＜0.01）；與婦科千金片組比較，TGP高劑量組 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3 表達(dá)水平均下調(diào)（均P＜0.01），見(jiàn)圖 3和表 5。

表5 各組大鼠子宮組織NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平比較

圖3 各組大鼠子宮組織NF-κB、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、Smad 同源物 2（Smad2）、Smad 同源物 3（Smad3）蛋白表達(dá)的電泳圖[a：假手術(shù)組；b：模型組；c：婦科千金片組；d：白芍總苷（TGP）低劑量組；e：TGP 中劑量組；f：TGP 高劑量組]

3 討論

慢性盆腔炎為女性上生殖道的常見(jiàn)病和多發(fā)病，患病率超過(guò)10%，與經(jīng)期、性生活衛(wèi)生、宮腔手術(shù)及流產(chǎn)等密切相關(guān)。臨床上主要通過(guò)給予足療程的廣譜抗菌藥物來(lái)治療慢性盆腔炎，但長(zhǎng)期應(yīng)用抗菌藥物可能導(dǎo)致人體菌群失調(diào)并產(chǎn)生耐藥性，增加治療難度[11]。近年來(lái)，隨著對(duì)中醫(yī)藥認(rèn)知的提升，中藥多靶點(diǎn)、多方位的整體調(diào)節(jié)且毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)逐漸得到關(guān)注，其在慢性病治療領(lǐng)域的應(yīng)用日漸廣泛。

白芍為我國(guó)傳統(tǒng)中藥品種，在《本經(jīng)》《別錄》等典籍中均有記載，其味苦、性微寒，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛之功效，用于血虛萎黃、脅痛，腹痛等癥的調(diào)治。TGP為中藥白芍的主要活性成分，包括芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等成分，具有良好的抗炎活性和免疫調(diào)節(jié)作用。婦科千金片由千斤拔、金櫻根、穿心蓮、功勞木、單面針、當(dāng)歸、雞血藤、黨參共八味中藥配伍組成，具有抑菌、抗炎、提高免疫力等多種藥理學(xué)作用，是臨床治療慢性盆腔炎的一線(xiàn)用藥，總有效率達(dá)86%[12]。機(jī)械損傷聯(lián)合混合細(xì)菌感染法制備的慢性盆腔炎動(dòng)物模型與人類(lèi)慢性盆腔炎的病理特征及發(fā)病機(jī)制十分相似，是目前最常用且公認(rèn)的造模方法[13]。本實(shí)驗(yàn)采用機(jī)械損傷聯(lián)合混合細(xì)菌感染的方法制備慢性盆腔炎大鼠模型后給予TGP進(jìn)行治療，以婦科千金片作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)TGP或婦科千金片治療能夠明顯改善慢性盆腔炎大鼠子宮水腫、柔韌度和活動(dòng)度，降低子宮粘連Verco評(píng)分和子宮系數(shù)，改善子宮上皮細(xì)胞增生、肌纖維紊亂、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病變，降低宮腔擴(kuò)張或粘連、上皮變性壞死、慢性炎癥浸潤(rùn)、內(nèi)膜充血水腫、上皮細(xì)胞增生病理評(píng)分，并且TGP高劑量組對(duì)子宮水腫及組織病理學(xué)改變的保護(hù)作用優(yōu)于婦科千金片組，提示TGP對(duì)慢性盆腔炎大鼠子宮具有保護(hù)作用。

慢性盆腔炎病理機(jī)制非常復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)在其疾病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。病原菌激活機(jī)體免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)機(jī)體炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β大量釋放，引發(fā)系列炎癥反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致子宮組織損傷；并且TNF-α、IL-1β作為炎性趨化因子能夠刺激粒細(xì)胞進(jìn)一步釋放炎癥因子，形成炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而加重炎癥損傷[14]。IL-10是機(jī)體關(guān)鍵的抗炎因子，對(duì)維持機(jī)體正常的免疫功能至關(guān)重要[15]。NF-κB是機(jī)體廣泛存在的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，具有促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1β合成與釋放并抑制IL-10合成的作用，在機(jī)體炎癥反應(yīng)中具有關(guān)鍵調(diào)控作用[16]；TGF-β1是一種受NF-κB調(diào)控表達(dá)的多效性因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡過(guò)程，并且對(duì)慢性炎癥、免疫應(yīng)答具有重要調(diào)控作用；Smad蛋白是TGF-β1下游信號(hào)傳導(dǎo)分子，其中Smad2、Smad3與受體結(jié)合被磷酸化活化后，能夠?qū)⑿盘?hào)傳遞到細(xì)胞核而促轉(zhuǎn)錄活化[17]。楊靜等[18]研究發(fā)現(xiàn)NF-κB/TGF-β1/Smad信號(hào)通路在慢性盆腔炎大鼠炎癥反應(yīng)及組織病理性損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。目前，TGP在臨床上主要用于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療，近年來(lái)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)TGP對(duì)腎臟、心肌等部位炎癥也具有抑制作用[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGP治療能夠明顯降低慢性盆腔炎大鼠血清TNF-α、IL-1β水平并提高IL-10水平，下調(diào)子宮組織NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)，并且 TGP 高劑量組上述作用優(yōu)于婦科千金片組，提示抑制NF-κB/TGF-β1/Smad信號(hào)通路可能是TGP對(duì)慢性盆腔炎大鼠子宮起到保護(hù)作用的重要分子機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)婦科千金片治療能夠明顯降低血清TNF-α、IL-1β水平并提高IL-10水平，提示婦科千金片對(duì)慢性盆腔炎大鼠炎癥反應(yīng)具有抑制作用，與楊堃等[21]和李鑫等[22]研究報(bào)道一致；但婦科千金片對(duì)NF-κB/TGF-β1/Smad通路相關(guān)蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響，說(shuō)明婦科千金片和TGP的作用機(jī)制可能不同。易麗貞等[23]研究發(fā)現(xiàn)婦科千金片對(duì)慢性盆腔炎大鼠炎癥反應(yīng)的抑制作用可能與調(diào)控Toll樣受體4-磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路有關(guān)。

綜上所述，TGP具有抑制慢性盆腔炎大鼠子宮粘連和組織病變的作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB/TGF-β1/Smad信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)論為T(mén)GP作為慢性盆腔炎治療備選藥物提供了理論支持。纖維化是慢性盆腔炎所致子宮組織病變的另一重要機(jī)制[24-25]，TGP能否通過(guò)抑制纖維化對(duì)其起到保護(hù)作用還有待于進(jìn)一步研究。