劉敏 唐蘭芳

哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為可逆性氣流阻塞、支氣管高反應(yīng)性和慢性炎癥，在世界范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和死亡率[1-2]。目前已知哮喘是由環(huán)境因素和遺傳因素間相互作用所引起的，但其發(fā)病機制尚未完全闡明。近年來越來越多的證據(jù)表明，表觀遺傳調(diào)控在哮喘發(fā)病中起重要作用[3-4]。

miRNA是一組進(jìn)化上高度保守的長度約19～22個核苷酸的單鏈非編碼 RNA。每個miRNA通過沉默靶mRNA來調(diào)節(jié)數(shù)百個編碼和非編碼基因。目前已有部分miRNA被報道可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及黏膜纖毛功能受損等參與哮喘的發(fā)病機制[2，5]，但研究標(biāo)本大多來自動物哮喘模型、成人肺組織或者哮喘兒童血清等。由于哮喘兒童肺組織難以獲得，而支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）是反映肺組織的最佳標(biāo)志物。本研究利用miRNA芯片分析哮喘兒童BALF細(xì)胞中miRNA水平，通過qRT-PCR對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行驗證，并對可能的靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，從而探討miRNA參與兒童哮喘發(fā)病中可能的作用機制。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年1月至2017年2月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院的哮喘患兒15例為哮喘組，哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2016年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[6]。所有患兒均接受過糖皮質(zhì)激素治療，近期無好轉(zhuǎn)或病情進(jìn)展，排除其他肺部疾病、免疫疾病及心血管系統(tǒng)疾病或BALF不合格患兒。選取同期本院確診為支氣管異物的12例患兒為對照組，異物均在24 h內(nèi)經(jīng)纖維支氣管鏡取出，排除右肺中葉異物、其他肺部疾病、免疫疾病、心血管系統(tǒng)疾病及過敏性疾病或BALF不合格患兒。因樣本數(shù)量限制，取哮喘組5例、對照組4例患兒的BALF細(xì)胞用于miRNA芯片檢測；再取哮喘組5例、對照組3例患兒的BALF細(xì)胞用于驗證miR-34/449家族；最后取哮喘組和對照組各5例患兒的BALF細(xì)胞用于驗證miR-200家族和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）基因。E-cadherin蛋白表達(dá)水平測定所用標(biāo)本為以上用于驗證miR-34/449家族和miR-200家族表達(dá)的所有患兒BALF細(xì)胞的上清液。兩組患兒在不同檢測過程中性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。本實驗獲得所有患兒家長或監(jiān)護人的同意，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過（浙兒倫申2015-HP-037）。

表1 不同檢測組患兒性別及年齡的比較

1.2 BALF收集 首先選定灌洗部位為右肺段中葉，所有患兒行纖維支氣管鏡操作前15～30 min靜脈注射馬來酸咪達(dá)唑侖（0.3 mg/kg）進(jìn)行全身麻醉，達(dá)到適當(dāng)?shù)穆樽砩疃群螅w維支氣管鏡經(jīng)鼻腔或口腔輕柔進(jìn)入，到達(dá)聲門前及氣管處分別通過細(xì)硅膠管滴注2%利多卡因進(jìn)行局部麻醉，進(jìn)入至右肺中葉后，快速注入37℃0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行肺泡灌洗（每次1 ml/kg，單次最大量為20 ml，共3次），結(jié)束后以25～100 mmHg（-3.3～-13.3 kPa）負(fù)壓吸引回收，裝入塑料容器內(nèi)。標(biāo)本均在4℃，300 g條件下離心10 min，分別收集BALF細(xì)胞、上清液用于進(jìn)一步研究，其中細(xì)胞用于RNA提取，上清液用于ELISA蛋白檢測。BALF合格標(biāo)準(zhǔn)為：（1）達(dá)到規(guī)定的回收量，即回收量大于總灌注量的40%；（2）紅細(xì)胞數(shù)不超過灌洗液細(xì)胞總數(shù)的10%；（3）上皮細(xì)胞數(shù)應(yīng)小于灌洗液細(xì)胞總數(shù)的3%。經(jīng)檢測入組對象的BALF均符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 miRNA芯片檢測 使用QIAGEN RNeasy微量試劑盒（德國凱杰公司）從BALF細(xì)胞中提取總RNA，使用AffymetrixGeneChip miRNA 4.0陣列（美國昂飛公司）對miRNA進(jìn)行檢測。使用FlashTagBiotin HSR RNA標(biāo)記試劑盒（美國昂飛公司），通過Poly(A)聚合酶標(biāo)記來自細(xì)胞的1 μg總RNA。按照使用建議，將 RNA與 AffymetrixGeneChip miRNA 4.0陣列雜交。使用GeneChip2雜交、洗滌和染色試劑盒（美國昂飛公司）和 GeneChip2 Scanner 3000 7G進(jìn)行染色、洗滌和掃描。使用 Affymetrix Command Console軟件進(jìn)行特征提取。原始數(shù)據(jù)按以下順序處理：背景檢測、RMA全局背景相關(guān)性、分位數(shù)歸一化、中值估計和使用 miRNA QC軟件工具（美國昂飛公司）進(jìn)行 log2轉(zhuǎn)換。

1.4 差異表達(dá)miRNA的驗證及靶基因的表達(dá)測定 采用qRT-PCR法檢測miRNA芯片檢測到的miR-34/449家族的6個miRNA和miR-200家族的7個miRNA的表達(dá)，以驗證是否與基因芯片結(jié)果一致，同時用以檢測靶基因E-cadherin的表達(dá)。用Trizol試劑（美國英杰生命技術(shù)有限公司）提取總RNA。使用NanoDrop Lite分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司）測量 RNA濃度。miRNA qRT-PCR使用miDETECT A TrackTMmiRNA qRT-PCR Starter Ki（t廣州銳博生物科技有限公司）。對于目標(biāo)基因E-cadherin的表達(dá)，使用GoScriptTM Reverse Transcription System獲得 cDNA，通過GoTaqqPCR Master Mix試劑盒（美國普洛麥格公司）對目標(biāo)基因表達(dá)進(jìn)行驗證。數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。U6和GAPDH分別作為miRNA和E-cadherin表達(dá)的內(nèi)參。miRNA的反向引物序列及內(nèi)參U6引物序列均由銳博公司設(shè)計并合成，所有引物序列見表2。

表2 引物序列

1.5 目標(biāo)基因分析和驗證 通過miRBase數(shù)據(jù)庫（http://www.mirbase.org/）、miRTarBase數(shù)據(jù)庫（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）和查閱文獻(xiàn)等選取miRNA-34/449和miRNA-200家族的靶基因E-cadherin，通過上述qRT-PCR法檢測E-cadherin基因的表達(dá)水平。使用BCA蛋白檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）測量 BALF上清液中的總蛋白量，使用人E-cadherin Quantikine ELISA試劑盒（美國R&D生物有限公司）測量E-cadherin的蛋白水平，其中E-cadherin蛋白與總蛋白的比值（E-cadherin/總蛋白蛋白比值）用于估計E-cadherin蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件和Graph-Pad Prism 6.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒中存在差異性表達(dá)的miRNA比較 兩組患兒存在65個差異表達(dá)的miRNA（圖1，見插頁）。哮喘組有22個miRNA比對照組增加了2倍或更多，顯著上調(diào)的 miRNA為 miR-143-3p、miR-424-3p、miR-199a-3p 和 miR-199b-3p，分別增加了 3.71、3.58、3.46 和3.46倍；其他上調(diào)的miRNA包括miR-3197、miR-4484、miR-503-5p、miR-1290、miR-1304-5p、miR-6126、miR-212-3p、miR-7515、miR-3135b、miR-6780b-5p、miR-4430、miR-6772-5p、miR-4417、miR-4485、miR-204-3p、miR-4533、miR-1183 和 miR-6758-5p，見表3。另外，哮喘組有43個miRNA呈低表達(dá)水平。miR-34/449家族的3個miRNA，包括 miR-34b-5p、miR-34b-3p和miR-34c-5p均顯著下調(diào)，僅為對照組的0.07、0.08和0.09倍。其他下調(diào)的miRNA包括miR-34/449家族的其他成員（如 miR-34c-3p、miR-449a）、miR-200 家族（miR-200a/b/c、miR-429 和 miR-141）、miR-23b/27b簇（miR-23b、miR-27b）、miR-92b、miR-100等。6個miR-34/449 家族的 miRNA（miR-34b-5p、miR-34b-3p、miR-34c-5p、miR-34c-3p、miR-449a和 miR-449b-5p）和 7 個miR-200 家族的 miRNA（miR-200a-3p、miR-200a-5p、miR-200b-3p、miR-200b-5p、miR-200c-3p、miR-429和miR-141-3p）減少，占哮喘兒童BALF細(xì)胞下調(diào)miRNA的 30.2%（13/43），見表 4。

表3 BALF細(xì)胞中22個表達(dá)上調(diào)的miRNA

表4 BALF細(xì)胞中43個表達(dá)下調(diào)的miRNA

圖1 兩組患兒中存在的65個差異表達(dá)的miRNA

2.2 差異表達(dá)miRNA驗證 由于miR-34/449家族的6個miRNA和miR-200家族的7個miRNA占所有下調(diào)miRNA的很大比例，因此本研究選取了這兩個miRNA家族進(jìn)行驗證。miR-34/449家族驗證顯示哮喘組患兒 miR-34b-5p、miR-34b-3p、miR-34c-5p、miR-34c-3p表達(dá)水平均低于對照組（均P＜0.05），而兩組患兒miR-449a和miR-449b-5p表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖2。miR-200家族驗證顯示哮喘組患兒miR-200a-5p、miR-200a-3p、miR-200b-5p、miR-200b-3p、miR-200c-3p 和 miR-141-3p表達(dá)水平低于對照組（P＜0.05），而兩組患兒miR-429比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖2 miR-34/449家族驗證結(jié)果（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖3 miR-200家族驗證結(jié)果（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 兩組患兒E-cadherin基因及蛋白表達(dá)水平比較 哮喘組患兒E-cadherin基因表達(dá)水平低于對照組（P＜0.05）。哮喘組患兒E-cadherin/總蛋白蛋白比值為（0.001 6±0.000 4）%，低于對照組的（0.003 5±0.000 7）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示哮喘組患兒E-cadherin蛋白表達(dá)水平低于對照組，見圖4。

圖4 E-鈣黏蛋白（E-cadherin）驗證結(jié)果（*P＜0.05）

3 討論

哮喘是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，以炎癥細(xì)胞（嗜酸性粒細(xì)胞、Th、巨噬細(xì)胞等）、活化結(jié)構(gòu)細(xì)胞（支氣管上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞）為主要效應(yīng)細(xì)胞，參與哮喘中的免疫應(yīng)答及氣道重塑。越來越多的研究表明，miRNA可通過調(diào)控炎癥細(xì)胞、氣道上皮或成纖維細(xì)胞的比例和功能變化在哮喘的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[7-9]。但是對于miRNA與兒童哮喘關(guān)系的研究大多通過血液、痰液或者哮喘動物模型來實現(xiàn)，直接通過患兒BALF來進(jìn)行的研究較少。因此相較于血液、痰液等，BALF檢測miRNA可以更準(zhǔn)確、直接地反映兒童哮喘肺部病理變化。

本研究發(fā)現(xiàn)在哮喘組與對照組患兒間存在miRNA的差異表達(dá)，提示miRNA參與了哮喘的發(fā)病機制，而差異表達(dá)的miRNA與之前的報道略有不同[10-11]，可能與樣本來源、疾病階段或嚴(yán)重程度有關(guān)，因此需要進(jìn)一步研究這些差異表達(dá)miRNA的細(xì)胞來源、特定表達(dá)機制和實際功能。盡管哮喘組中存在22個上調(diào)miRNA，且miR-143-3p在哮喘組呈高表達(dá)水平，但筆者發(fā)現(xiàn)哮喘中呈低表達(dá)miRNA約占總體的2/3（43/65），因此推測哮喘中miRNA大多為表達(dá)下調(diào)。

已知一個miRNA家族中的miRNA通常具有相似的miRNA序列，可能調(diào)控相似基因并發(fā)揮相似的作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-34家族的6個miRNA和miR-200家族的7個miRNA在哮喘兒童中表達(dá)下調(diào)，并通過qRT-PCR驗證了miR-34/449家族的4個miRNA和miR-200家族的6個在哮喘兒童中呈低表達(dá)水平。已知轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）受體介導(dǎo)的信號通路可通過調(diào)節(jié)氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑等過程，在哮喘中發(fā)揮重要作用[12-13]?；谀[瘤研究指出，miR-34/449家族和miR-200家族可與TGF-β形成復(fù)雜的反饋環(huán)，包括SNAIL 同源物 1（snail homolog 1,SNAI1）/miR-34雙重負(fù)反饋環(huán)和鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒（zinc-finger E-box binding homeobox,ZEB）/miR-200雙重負(fù)反饋環(huán)，且SNAI1和ZEB1/2的表達(dá)對E-cadherin均表現(xiàn)為抑制作用[14]。本研究通過生物信息數(shù)據(jù)庫預(yù)測E-cadherin是兩個家族的靶基因，并在基因和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)哮喘患兒E-cadherin表達(dá)下降。E-cadherin是維持上皮完整性和通過釋放生長因子和促炎因子介導(dǎo)氣道上皮免疫功能的重要黏附分子，其丟失和重新分布可能促進(jìn)上皮細(xì)胞的炎癥活動，在哮喘的發(fā)病機制中起重要作用[15]。因此miR-34家族和miR-200家族可能通過調(diào)控E-cadherin的表達(dá)參與哮喘的發(fā)病機制，為哮喘的防治提供新靶點。此外根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，預(yù)測兩種miRNA家族參與哮喘的信號通路可能為TGF-β受體介導(dǎo)的信號通路。

本研究存在以下局限：首先，對照組實際上并不是正常的兒童，雖然本研究選擇了24 h內(nèi)去除異物的患兒，但BALF細(xì)胞可能與正常兒童的BALF細(xì)胞存在一些差異。其次，由于樣本量較少，BALF中的細(xì)胞有限，用于miRNA芯片、qRT-PCR和 ELISA的樣本來自不同的患兒，并不是一一對應(yīng)。最后，miRNA與靶基因之間的關(guān)系沒有通過進(jìn)一步的實驗（基因敲除、免疫組化等實驗）來驗證。因此對于哮喘中具體的miRNA調(diào)控機制的認(rèn)識需要更進(jìn)一步、更深入的研究來明確。