楊世麗,常 巍,袁 夢(mèng),黃雅貞,陳仕龍,馬燕梅
[1. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院),福建 福州 350002;2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,福建 福州 350013]
【研究意義】鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是由鴨病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)引起的一種發(fā)病急、傳播快、病程短和死亡率高的急性傳染病[1-2]。DHV主要感染3周齡內(nèi)的雛鴨,以1周齡內(nèi)雛鴨最為易感[3]。病鴨的臨床癥狀主要表現(xiàn)為抽搐和角弓反張,典型的病理特征為肝臟腫大和瘀斑樣出血[4-5]。DHV的3個(gè)血清型在抗原上互不交叉,可分別引起I型、II型和III型DVH[6]。然而,DVH的變異株層出不窮,現(xiàn)有的相關(guān)研究并不充足,生產(chǎn)上存在較大的防治缺口,因此,臨床上開(kāi)展DVH的深入研究,了解DVH的病原性特點(diǎn)和流行規(guī)律,并研究有效的防治技術(shù),對(duì)減少DHV對(duì)鴨養(yǎng)殖業(yè)的影響十分必要?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】I型鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus type I,DHV-I)基因組為7700 nt的單股正鏈RNA,編碼一個(gè)約6750 nt的開(kāi)放閱讀框(Open reading frame,ORF)和約626 nt的非編碼區(qū)(Untranslated region,UTR)5′UTR、3′UTR[7-8]。ORF區(qū)編碼多聚蛋白,多聚蛋白在翻譯過(guò)程中不斷被自身編碼的蛋白酶水解為結(jié)構(gòu)蛋白P1和非結(jié)構(gòu)蛋白P2、P3[9]。結(jié)構(gòu)蛋白P1包括VP0、VP1和VP3,位于病毒核衣殼,可決定病毒的抗原性和血清型[7,10]。目前在世界各地發(fā)生和流行的主要是DHV-Ⅰ。黃均建于1963年首次報(bào)道了本病在中國(guó)的發(fā)生[11],王平等于1980年在北京首次分離得到DHV-I[12]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】VP1蛋白基因編碼的主要抗原位點(diǎn),對(duì)DHV的致病性、進(jìn)化和毒力起至關(guān)重要的作用[13],而關(guān)于全長(zhǎng)VP1蛋白的兔多抗制備和應(yīng)用方面的研究相對(duì)較少。2015年福建某鴨場(chǎng)出現(xiàn)疑似鴨肝炎病死鴨,病死鴨出現(xiàn)頭部上仰、腳部后翻的角弓反張的癥狀,肝臟出現(xiàn)腫大且有密集出血點(diǎn),膽囊出現(xiàn)腫大充血,脾臟和胰腺也出現(xiàn)明顯的腫大。其病原有待進(jìn)一步分離鑒定?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究取病死鴨肝臟組織進(jìn)行病毒分離鑒定,為確定該病毒的基因型進(jìn)行了全基因測(cè)序,并利用pGEX-4T-1載體構(gòu)建VP1的高效表達(dá)系統(tǒng),制備兔多克隆抗體,用Westernblotting檢測(cè)驗(yàn)證其特異性,為補(bǔ)充DHV的基因庫(kù)及研究和控制DVH的發(fā)生和流行與I型DHV的臨床快速檢測(cè)提供參考依據(jù)。
試驗(yàn)鴨取自福建某鴨場(chǎng)疑似鴨肝炎病死鴨,2015年采集并進(jìn)行病毒分離,分離后的病毒于-80 ℃保存,進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。非免疫櫻桃谷鴨的鴨胚及健康櫻桃谷雛鴨購(gòu)自漳州昌龍農(nóng)牧有限公司和福州創(chuàng)新農(nóng)牧有限公司。H9N2、DHV-I型標(biāo)準(zhǔn)毒株和pGEX-4T-1為實(shí)驗(yàn)室原有保存。感受態(tài)細(xì)胞E.coilDH5α和E.coilBL21(DE3)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
Trizol 購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所,膠回收試劑盒購(gòu)自全式金生物公司,TRYPTONE、YEAST EXTRACT、Agar購(gòu)自O(shè)XOID公司,核酸限制性?xún)?nèi)切酶BamH I-HF和SalI-HF購(gòu)自NEB公司,T4DNA連接酶、Pyrobest、Primer STAR高保真DNA聚合酶、Taq酶、Oligo(dT)18 Primer、Recombinant Dnase I、核酸Marker DL2000等購(gòu)自TaKaRa公司,DNA純化回收、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司。
無(wú)菌采集0.05 g有明顯病癥的雛鴨肝臟,置于2 mL EP管中,加1 mL無(wú)菌雙抗生理鹽水和兩顆滅菌鋼珠,置于高容量組織研磨器70 Hz研磨80 s,制成勻漿后凍融3次。置于離心機(jī)4 ℃、3000 r·min-1離心30 min,吸取上清于1.5 mL EP管中,4 ℃、12000 r·min-1再離心30 min,取出上清液,用0.22 μm 濾膜過(guò)濾,濾液放入-80 ℃冰箱備用。
取20枚9~10日齡的非免疫櫻桃谷鴨胚,分2組,每組10枚,分別用0.2 mL病料和0.2 mL生理鹽水接種尿囊腔,接種后置于37 ℃恒溫箱中孵化,去除24 h內(nèi)死亡的鴨胚,收集24~120 h死亡鴨胚的尿囊液并觀察鴨胚胎的變化。收集的尿囊液進(jìn)行連續(xù)傳代。觀察雛鴨致死率。
分別采取鴨、雞、小鼠和兔的血液檢測(cè)病毒尿囊液血凝性,H9N2為陽(yáng)性對(duì)照。血凝試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[14]的方法。
選擇非免疫櫻桃谷鴨胚孵化的1 d的櫻桃谷鴨20只,分為2組,每組10只。一組肌肉注射分離的病毒,每只0.5 mL,另一組肌肉注射生理鹽水,每只0.5 mL,分開(kāi)飼養(yǎng),觀察發(fā)病情況。
1.7.1 引物設(shè)計(jì) 參照 GenBank 上已發(fā)布的DHVI的基因組序列,根據(jù)保守序列區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)引物,擴(kuò)增目的片段,預(yù)期長(zhǎng)度為992 bp。F:5′-TCTGCC ATTTACATCAACCAC- 3′,R:5′-TGCCAACAAC TAAGATAGGTC- 3′,由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。
1.7.2 病毒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取0.05 g病變肝臟,加入1 mL Trizol及兩顆鋼珠于2 mL EP管中,置于高通量組織研磨器70 Hz,研磨80 s。取出鋼珠,加入200 μL氯仿,振蕩15~20 s。4 ℃、12000 r·min-1離心12 min后,吸取上清液至1.5 mL EP管。加入200 μL異丙醇至EP管中,溫和顛倒數(shù)次后冰上靜置20 min,4 ℃、12000 r·min-1離 心10 min,去 除 上清。加75%乙醇(DEPC 配制)1 mL清洗沉淀,4 ℃、7500 r·min-1離心5 min,清洗兩次,去除乙醇后,晾干3~5 min,加30~50 μL DEPC水溶解提取物。
反轉(zhuǎn)錄采用50 μL體系,即先加入RNA 4 μg、Oligo(dT) 181 μL、DEPC水補(bǔ)至10 μL,反應(yīng)條件為70 ℃ 5 min,后 加 入10 mmol·L-1dNTP 1.5 μL、5×buffer 10 μL、RRI 1 μL、M-MLV 1 μL、DEPC水26.5 μL,反應(yīng)條件為42 ℃ 1 h,72 ℃ 15 min。
1.7.3 PCR擴(kuò)增 以制備好的cDNA 1 μL,加入相應(yīng)的上、下游引物各1 μL,ddH2O 32.5 μL,5×buffer 10 μL,dNTP(2.5 mmol·L-1) 4 μL,Primer STAR酶0.5 μL,反應(yīng)體系50 μL。擴(kuò)增條件為:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,Tm-5 ℃ 30 s,72 ℃ 1 kb·min-1,35個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物10 μL,混勻后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,使用凝膠成像儀觀察目的條帶。
1.7.4 全基因測(cè)序及同源性分析 將提取的分離病毒的RNA 委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行全基因序列測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與GenBank中12株亞洲地區(qū)報(bào)道的已知DHV-I毒株進(jìn)行比較分析。
1.8.1 引物設(shè)計(jì) 參照Fujian2015株VP1蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物,并在上游和下游引物分別引入BamH I和SalI酶切位點(diǎn),預(yù)期擴(kuò)增片段大小為714 bp。具體引物序列如下:F5′-CGCGGATCCATGGGT GATTCCAACCAGTTGGGGGATGATGAG- 3′,R:5′-ACGCGTCGACTCATTCAATTTCCAGATTGAG TTCAAATGCTAG- 3′,由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。
1.8.2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-VP1的構(gòu)建與鑒定 使用上述引物PCR擴(kuò)增目的片段并純化回收,反應(yīng)體系 為DNA 30 μL,BamH I 1 μL,SalI 1 μL,10×Buffer 5 μL,ddH2O 13 μL的體系,載體DNA≤ 2 μg,BamH I 1 μL,SalI 1 μL,10×Buffer 4 μL,ddH2O 加至40 μL的體系,用BamH I和SalI進(jìn)行雙酶切,混勻后置37 ℃水浴1 h,目的DNA用DNA純化回收試劑盒進(jìn)行純化。將雙酶切并純化后的目的片段和載體按照下述體系進(jìn)行連接,輕輕混勻后在16 ℃金屬浴中連接12~16 h:目的片段8 μL,載體DNA 2 μL,T4 DNA Ligase 1 μL,10×T4 DNA Ligase Buffer 1.5 μL,ddH2O 2.5 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α后搖菌培養(yǎng),菌液PCR驗(yàn)證陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定,并送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。
空載體pGEX-4T-1和重組陽(yáng)性質(zhì)粒pGEX-4T-1-VP1轉(zhuǎn)化至感受態(tài)BL21(DE3)中,涂板并37 ℃過(guò)夜。在含氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中接種挑取的單菌落,37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)12 h。將菌液以1∶100的比例接于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)液中,37 ℃培養(yǎng)2~3 h至OD600nm值約0.5時(shí)加入終濃度為0.5 mmol·L-1的誘導(dǎo)劑異丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)。4 ℃、8000 r·min-1離心3 min,收集菌體沉淀,用PBS重懸,加入2×loading buffer,煮沸5 min,分別取20 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳觀察是否有目的條帶,并進(jìn)行Western-blotting檢測(cè)。
將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-VP1經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后得到重組蛋白GST-VP1,分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,切下對(duì)應(yīng)大小位置的目的條帶,用于免疫兔子,多克隆抗體的制備由北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司協(xié)助完成。
注射病料濾液的鴨胚,9枚死亡,1枚活力很微弱。注射生理鹽水的鴨胚均存活,且發(fā)育正常。正常胚體無(wú)出血點(diǎn)(圖1-A),肝臟呈黃色,肝細(xì)胞排列規(guī)則有序,未見(jiàn)明顯異常(圖1-B);死亡的胚體全身充血,肝臟質(zhì)地脆、腫大及出血(圖1-C)。與正常肝細(xì)胞對(duì)比,病死鴨胚肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞腫大、變性,細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂;炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主)散在浸潤(rùn)(圖1-D)。該分離病毒在鴨胚連續(xù)傳6代后對(duì)雛鴨致死率約為70%。
圖1 鴨胚肝臟及其HE染色(×200)Fig. 1 Liver tissues with and without HE-staining from duck embryo
分離病毒在鴨、雞、小鼠和兔4種血液中均未出現(xiàn)血凝現(xiàn)象,而陽(yáng)性對(duì)照H9N2在鴨、雞血液中出現(xiàn)血凝現(xiàn)象(圖2),表明該分離病毒無(wú)血凝性。
圖2 分離病毒的血凝性檢測(cè)Fig. 2 Hemagglutination detection on isolated viruses
注射病料研磨液的雛鴨,48 h內(nèi)死亡率為100%,出現(xiàn)角弓反張,肝臟腫大、質(zhì)地脆、有明顯出血點(diǎn)等病理特征(圖3)。
圖3 動(dòng)物感染及其剖檢特征Fig. 3 Infection and dissection on animals
用設(shè)計(jì)的DHV-I的引物,對(duì)DHV-I標(biāo)準(zhǔn)株和Fujian2015通過(guò)RT-PCR進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。Fujian2015的擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序后與NCBI上的DHV-I標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行序列對(duì)比,證實(shí)Fujian2015的擴(kuò)增片段為DHV-I中的一段基因(圖4),根據(jù)此結(jié)果進(jìn)行病毒的全基因測(cè)序。
圖4 DHV-I的PCR鑒定Fig. 4 PCR identification on DHV-I
全基因序列測(cè)序后獲得該病毒的基因全長(zhǎng)為7654 bp,將擴(kuò)增的病毒全基因序列與NCBI中的DHV序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)僅能與DHV-I型全基因組序列重合,不能與DHV-Ⅱ型和DHV-Ⅲ型重合,因此確定為I型DHV。將其與12株亞洲地區(qū)報(bào)道的已知DHV-I毒的進(jìn)行核苷酸同源性分析,結(jié)果如圖5所示,該分離病毒核苷酸與毒株DQ226541.1有很高的同源性,高達(dá)99.4%。VP1氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)分析如圖6所示,該分離病毒VP1氨基酸序列與其他DHVI的VP1氨基酸序列比較,與毒株DQ226541.1和HQ232303.1親緣關(guān)系較近。運(yùn)用SnapGene軟件將該病毒與12株已知DHV-Ⅰ型病毒的VP1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析顯示,該毒株的VP1氨基酸序列有3個(gè)位點(diǎn)與其他大多數(shù)毒株具有一定差異性(表1)。
圖5 病毒全基因組序列同源性分析Fig. 5 Homology of genome-wide sequences of isolated virus
圖6 VP1氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 6 VP1 amino acid sequence evolutionary trees
表1 分離的病毒與部分DHV毒株的VP1氨基酸序列比對(duì)Table 1 VP1 amino acid sequences of isolated and partial DHV viruses
用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增,并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。在圖7中,擴(kuò)增片段約為700 bp(VP1基因?yàn)?14 bp),與預(yù)期的片段相符。
圖7 VP1基因PCR擴(kuò)增Fig. 7 PCR amplification of VP1
使用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和SalI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,結(jié)果表明重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-VP1構(gòu)建成功。圖8為重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-VP1的雙酶切鑒定結(jié)果,雙酶切后目的片段大小與預(yù)期相符(714 bp)。鑒定正確的重組質(zhì)粒送擎科公司測(cè)序。
圖8 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-VP1的酶切鑒定Fig. 8 Restriction digestion on recombinant plasmid pGEX-4T-1-VP1
重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-VP1表達(dá)產(chǎn)物即融合蛋白GST-VP1,是在37 ℃、0.5 mmol·L-1IPTG、180 r·min-1的條件下誘導(dǎo)6 h后獲得的。圖9中,用SDS-PAGE檢測(cè)相同條件下空載體pGEX-4T-1誘導(dǎo)前后的表達(dá)產(chǎn)物和重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-VP1誘導(dǎo)前后的表達(dá)產(chǎn)物,結(jié)果顯示pGEX-4T-1-VP1誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物出現(xiàn)約52 kDa的條帶,與預(yù)期相符,融合蛋白GSTVP1誘導(dǎo)表達(dá)成功。
圖9 融合蛋白GST-VP1的SDS-PAGE分析Fig. 9 Fusion protein GST-VP1 by SDS-PAGE
將誘導(dǎo)后的空載體pGEX-4T-1和重組蛋白GSTVP1進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)移至NC膜上進(jìn)行Western-blotting分析,結(jié)果(圖10)顯示融合蛋白GST-VP1可與抗GST標(biāo)簽鼠單克隆抗體發(fā)生反應(yīng),特異性條帶大小約52 kDa,而誘導(dǎo)后的空載體pGEX-4T-1與抗GST標(biāo)簽鼠單克隆抗體發(fā)生反應(yīng),特異性條帶大小約25 kDa,與預(yù)期相符。該結(jié)果再次驗(yàn)證了融合蛋白GST-VP1表達(dá)正確。
圖10 融合蛋白GST-VP1的Western-blotting分析Fig. 10 Western-blotting on fusion protein GST-VP1
用重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-VP1的表達(dá)產(chǎn)物即融合蛋白GST-VP1作為抗原制備兔源多抗血清,將獲取的血清稀釋后作為一抗與感染鴨肝臟組織蛋白樣品和H9N2感染的A549細(xì)胞反應(yīng),結(jié)果表明,多抗血清不與H9N2感染的A549細(xì)胞反應(yīng),僅與DHV感染的鴨肝臟反應(yīng),特異性條帶大小約為26 kDa,用NP抗體與相同樣本反應(yīng),結(jié)果顯示NP蛋白可與H9N2感染的A549細(xì)胞反應(yīng)(圖11),與預(yù)期相符,說(shuō)明制備的VP1多抗血清可特異性識(shí)別感染鴨肝臟中DHV表面的VP1抗原。
圖11 VP1多抗血清的Western-blotting分析Fig. 11 Western-blotting on poly-antiserum against VP1
DVH在我國(guó)許多養(yǎng)鴨地區(qū)均有不同程度的發(fā)生和流行,一旦發(fā)病,傳播速度快,死亡率高,給我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[14]。近年來(lái)快速發(fā)展的鴨只養(yǎng)殖行業(yè),不斷增大的集約化密集養(yǎng)殖力度,DHV-I型暴發(fā)日齡的提前和疫情規(guī)模的增大等多種因素促使生產(chǎn)上急需有效的防治技術(shù),因此了解DHV-I型的病原性特點(diǎn)和流行規(guī)律,研究相應(yīng)有效的防治技術(shù)十分必要[15]。
由于DHV-I型結(jié)構(gòu)蛋白P1位于暴露在外部環(huán)境的衣殼表面,易被宿主作為免疫應(yīng)答靶向蛋白,而其VP1蛋白基因編碼了主要的抗原位點(diǎn),在決定病毒抗原性中發(fā)揮重要作用,因此VP1蛋白基因是預(yù)防DVH的基因工程苗的重要基因之一[16]。VP1包含多個(gè)刺激B和T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)反應(yīng)的中和抗原表位,并誘導(dǎo)體內(nèi)保護(hù)性抗體的產(chǎn)生,可用作檢測(cè)病毒感染的可靠指標(biāo)。針對(duì)這一特性,可通過(guò)檢測(cè)抗VP1蛋白的血清抗體來(lái)監(jiān)測(cè)DHV-I的中和抗體水平[17]。
本試驗(yàn)對(duì)一養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生的疑似DVH的病鴨進(jìn)行了病毒分離鑒定、全基因測(cè)序并分析了其血清型,為補(bǔ)充DHV的基因庫(kù)及研究DVH的流行規(guī)律提供一定的理論依據(jù)。目前針對(duì)DHV-I的檢測(cè)方法主要有RT-PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和中和試驗(yàn)。本研究使用的檢測(cè)方法為RT-PCR擴(kuò)增基因序列,與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和中和試驗(yàn)相比,本試驗(yàn)采用的方法更加穩(wěn)定,而且可以確定毒株來(lái)源。本研究成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX- 4T-1-VP1,并建立了融合蛋白GST-VP1的高效表達(dá)體系。經(jīng)SDS-PAGE和Westernblotting檢測(cè),表達(dá)的融合蛋白GST-VP1以包涵體的形式存在,蛋白分子量約為52 kDa。用該蛋白制備兔源多抗血清,Western-blotting檢測(cè)結(jié)果顯示VP1多抗血清能夠特異性地識(shí)別病毒的VP1蛋白,證實(shí)了VP1蛋白具有良好的抗原性,說(shuō)明了VP1多抗血清可用于VP1蛋白表達(dá)的特異性檢測(cè),可作為病原學(xué)診斷的有效補(bǔ)充,為鴨肝炎疫病的防控提供參考[18]。