徐旺，王禹，王嫚，王穎慧，王江峰

蘇州大學法醫(yī)學系，江蘇 蘇州215000

近年來，法醫(yī)昆蟲學的相關(guān)研究進展十分迅速，研究者通過實驗已獲得了大量嗜尸性蠅類的生長發(fā)育數(shù)據(jù)。現(xiàn)場勘驗人員通常利用形態(tài)學方法對案發(fā)現(xiàn)場出現(xiàn)的嗜尸性蠅類進行種屬鑒別，結(jié)合相應(yīng)的蠅類生長發(fā)育數(shù)據(jù)，即可有效地估計死亡時間（postmortem interval，PMI）[1]。

然而在實際工作中，形態(tài)學鑒別方法并不總是有效的。一方面，案發(fā)現(xiàn)場收集的蠅類樣本可能為低齡幼蟲或蛹，有些樣本是不完整的，增加了利用形態(tài)學方法進行種屬鑒別的難度。另一方面，大部分現(xiàn)場勘驗人員缺乏昆蟲學知識，難以通過形態(tài)學方法對現(xiàn)場的蠅類樣本進行鑒定。

隨著DNA 檢測和分析技術(shù)的飛速發(fā)展，法醫(yī)昆蟲學領(lǐng)域逐漸嘗試應(yīng)用各種分子生物學方法對法醫(yī)學昆蟲（尤其是嗜尸性蠅類）進行種屬鑒定，如限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）[2]、擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFL）[3]等。然而大量研究[4-6]表明，DNA 條形碼技術(shù)（DNA barcoding）可以更有效地對嗜尸性蠅類進行種屬鑒別。陳慶等[4]通過對線粒體DNA 上的細胞色素c 氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）基因1 076 bp序列的測定和比較分析，成功地將不同地點采集的7個嗜尸性蠅類物種進行了區(qū)分，序列信息的聚集結(jié)果和形態(tài)學鑒定的種類歸屬完全一致。GUO等[5]利用700bp的COⅠ基因序列和678 bp的period基因序列對9個麻蠅物種進行了鑒定。MáRQUEZ-ACERO 等[6]通過分析599 bp 的COⅠ基因序列，鑒定了哥倫比亞地區(qū)的6 種麗蠅。在眾多基因中，線粒體DNA 的COⅠ基因被證實能夠?qū)Υ蟛糠质仁韵夘愇锓N進行高效的區(qū)分，因此也是法醫(yī)昆蟲學分子鑒定研究中最常用的基因[4]。

雖然此前對于蠅類鑒定的研究很多，但是，研究所采用的蠅類樣本多為使用小塊肉或者小型動物尸體放置于自然環(huán)境所采集的，且主要采集的是成蟲，這就存在以下問題：（1）采集的蠅類可能只是在尸體環(huán)境停留而并不取食，并非嗜尸性蠅類。（2）樣本數(shù)量較少，多數(shù)蠅類物種只有1 只個體，難以保證所獲得序列的準確性。（3）研究所采用的基因及其引物沒有統(tǒng)一的指標。因此想要解決某一地區(qū)的嗜尸性蠅類的種屬鑒別問題時不知道使用哪種引物和指標，導致嗜尸性蠅類分子鑒定研究的推廣遇到阻礙。

鑒于以上原因，本研究的蟲源全部來自本實驗室已經(jīng)研究過生長發(fā)育規(guī)律的種類，均來自長三角地區(qū)，且在本實驗室飼養(yǎng)繁殖多代，并被證明是嗜尸性昆蟲，擬通過基于COⅠ基因片段序列對長三角地區(qū)常見嗜尸性蠅類的種屬進行分子鑒定，以期為推斷死亡時間提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 蟲源

依據(jù)《中國常見蠅類檢索表》進行形態(tài)學種類鑒定，本研究中的7 個蠅類物種分別為大頭金蠅Chrysomya megacephala、緋顏裸金蠅Chrysomya rufifacies、巨尾阿麗蠅Aldrichina grahami、廄腐蠅Muscina stabulans、棕尾別麻蠅Boettcherisca peregrina、絲光綠蠅Lucilia sericata和肥軀金蠅Chrysomya pinguis，分別在2015—2019 年采自于野外動物尸體上，并經(jīng)過實驗室多代培養(yǎng)，遺傳穩(wěn)定（表1）。

表1 嗜尸性蠅類的生物學分類Tab.1 Biological classification of necrophagous flies

1.2 DNA 提取、PCR 擴增和測序

使用HighPrep? Insect DNA 試劑盒（美國Mag-Bio Genomics 公司），根據(jù)說明書操作提取全基因組DNA。本研究的各個物種均來自該物種的同一母體，所以不進行種內(nèi)遺傳差異檢測，每個蠅類物種取2～5只進行DNA 提取，每個個體提取得到20 μL 的DNA樣本。

通過COⅠ基因的通用引物進行PCR 擴增，引物序列為：LCO-1490（5'-GGTCAACAAATCATAAAGATA TTGG-3'）和HCO-2198（5'-TAAACTTCAGGGTGACCA AAAAATCA-3'）。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，包括2 μL（50～200 ng/μL）的模板DNA、12.5 μL 的2×GoTaq?綠色Master Mix（美國Promega 公司）、各1 μL 的上下游引物（50 μmol/L），添加無核酸酶水至反應(yīng)體系為25 μL。PCR 擴增循環(huán)參數(shù)：95 ℃2 min；95 ℃30 s，45 ℃30 s，73 ℃1 min，共30 個循環(huán)；73 ℃5 min，于4 ℃保存。

擴增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司按Sanger 測序方法完成測序。

1.3 序列分析

使用SnapGene Viewer 4.3.11 軟件（美國Insightful Science 公司）查看測序結(jié)果，對比正反向測序結(jié)果拼接獲得目的序列。將序列上傳至GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GenBank），經(jīng)BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）查詢與數(shù)據(jù)庫中所有已知核酸序列進行序列同源性搜索比對。通過MEGA 7.0.26 軟件（https://www.megasoftware.net/）以Kimura 2-parameter模型計算堿基組成和種間進化分歧率，以鄰接法（neighbor joining method，NJ）和非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并以鱗翅目的小地老虎Agrotis ipsilon作為外群，Bootstrap 值為500。

2 結(jié)果

2.1 種間進化分歧率分析

種間進化分歧率（表2）結(jié)果顯示，種間進化分歧率最大的是廄腐蠅與棕尾別麻蠅，達到了15.3%；而種間進化分歧率最低的是大頭金蠅與肥軀金蠅，為2.2%。

表2 種間進化分歧率Tab.2 Sequence divergence between species（%）

2.2 堿基組成分析

將正反向序列拼接后，獲得658 bp 的目的序列（表3）。本研究中蠅類物種的平均堿基組成為A（30.14%）、T（38.23%）、C（15.98%）、G（15.65%），其中A+T（68.37%）遠高于C+G（31.63%）。

表3 COI基因序列的核苷酸頻率分布Tab.3 Summary of nucleotide frequency distribution for COI gene sequences（%）

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

本研究中的蠅類物種系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，7個雙翅目物種聚集在一起，且均與作為外群的鱗翅目的小地老虎距離較遠。在兩種系統(tǒng)發(fā)育樹中，大頭金蠅、肥軀金蠅和緋顏裸金蠅3 個物種均聚集在一簇，且支持度較高（＞95%）。在NJ 樹中，多個分支的支持度極低（＜50%），且與生物學分類（表1）并不一致，如蠅科的廄腐蠅與麻蠅科的棕尾別麻蠅聚集成了一簇；而在UPGMA 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，5 個麗蠅科的物種聚集成簇，其與廄腐蠅（蠅科）間的距離相較于棕尾別麻蠅（麻蠅科）間更近，且各分支支持度均較高（＞85%），與生物學分類（表1）相符。故傾向于接受UPGMA 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果。

圖1 COI系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree for COI gene sequences

3 討論

本研究從3 個科的蠅類（麗蠅科、麻蠅科和蠅科）中提取線粒體COⅠ基因，采用的蠅類樣本均來自經(jīng)過實驗室多代培養(yǎng)的種群。本研究的主要目的是驗證通過COⅠ基因?qū)﹂L三角地區(qū)的常見嗜尸性蠅類進行分子鑒定的可靠性。

利用UPGMA 對雙翅目3 科7 種常見嗜尸性蠅類樣本構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，近緣種屬形成姊妹簇或樹形的分支部分，再構(gòu)成不同科的進化樹分支。聚類效果較好，且與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致。整體上可以將7 種蠅類分麗蠅科、蠅科、麻蠅科三大分支，所有樣本均位于某一特定的分支上，盡管不能對所有物種進行準確鑒別，但對物種的鑒定起到了很好的驗證和補充。

線粒體DNA 的進化和遺傳速度快，不需要基因重組。因此，在評估昆蟲類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系方面，線粒體DNA 比核DNA 更具優(yōu)勢[7]。其中，COⅠ基因已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學上重要的蠅類鑒定[8]。然而，基因條形碼技術(shù)對近源物種進行鑒定時的效果并不十分理想。例如，BHARTI 等[9]通過使用一段1 423 bp的COⅠ基因片段對印度地區(qū)的常見嗜尸性麗蠅進行分子鑒定，結(jié)果表明當使用該基因片段時，星島金蠅Chrysomya chani和大頭金蠅2 個物種的種間進化分歧率極低（0.11%），無法將這兩個物種進行區(qū)分。因此，DNA 條形碼技術(shù)并不能解決所有的種屬鑒別的問題。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，同時使用多個基因進行分子鑒定是有必要的，這樣可以增加鑒定的準確率。

為了可靠地進行物種的分子鑒定，目標種群具有較高的種間遺傳多樣性（＞3%）是非常重要的[10-11]。在本研究中，除了大頭金蠅和肥軀金蠅2 個物種之間的種間進化分歧率（2.2%）小于3%以外，其他物種間均大于3%，可以很好地區(qū)分這些物種。大頭金蠅和肥軀金蠅之間的進化分歧率較低是可以解釋的，因為兩者是近源物種，并且先前也有研究[12]表明，近源的金蠅物種有非常低的種間進化分歧率。因此，可能需要增加其他基因片段，如核基因ITS2或cytb等[13]，有待進一步研究。

對所得樣本的COⅠ基因進行核苷酸頻率分析，結(jié)果顯示堿基組成具有明顯的AT 偏倚，這與此前的大多數(shù)研究一致[14]。根據(jù)本研究中UPGMA 法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹，麗蠅科與蠅科物種間的距離相較于麗蠅科與麻蠅科更近，這說明麗蠅科與蠅科的親緣關(guān)系可能更為密切，該結(jié)果也與卓犖等[15]的研究結(jié)果相符合。不同科的蠅類物種分別位于進化樹上的不同分支，且各分支的Bootstrap 檢驗可信度均大于85，說明聚類結(jié)果較可靠，能夠有效區(qū)分。此外，系統(tǒng)進化樹中位于同一分支的兩對物種間的種間進化分歧率為各物種間進化分歧率中最低，證實了結(jié)果的可靠性。

總而言之，本研究驗證了分子鑒定技術(shù)在長三角地區(qū)常見嗜尸性蠅類種屬鑒別中的可行性，同時證實了COⅠ基因片段序列能夠較為準確地對不同蠅種的種屬進行鑒別。今后的研究，既要對嗜尸性蠅類物種進行全面的研究，也要對其他嗜尸性昆蟲進行分子鑒定的探究，從而為PMI 推斷提供有力的支撐。