涂海霞，曹敏，王守星，于青云，黃河

南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院病理與臨床檢驗(yàn)中心，江蘇南京 211100

流感病毒是臨床中較為常見(jiàn)的呼吸道感染病原體，常造成鼻腔、咽喉部的急性炎癥，影響著人類的身體健康及生活質(zhì)量[1]。NKG2D是NK細(xì)胞表面的活化性受體，屬于跨膜性受體，分子量大約為42kD，能與MHC-Ⅰ類相關(guān)分子Α和B結(jié)合，通過(guò)PI3K通路，利用相關(guān)DAP10多肽活化NK細(xì)胞的活性[2-3]。有研究表明，NKG2D和它的多種配體共同組成的一個(gè)強(qiáng)大的壓力誘導(dǎo)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，可以對(duì)受感染、發(fā)炎和惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生一定的抵抗作用，并且在抗腫瘤免疫監(jiān)視中起決定性作用[4-5]。流感病毒感染呼吸道上皮細(xì)胞后，還誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列促炎癥因子。細(xì)胞因子是由多種細(xì)胞(特別是免疫細(xì)胞)所產(chǎn)生、具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。細(xì)胞因子種類繁多、功能各異，它們?cè)诿庖呒?xì)胞的分化發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6-7]。該研究通過(guò)檢測(cè)該院2019年3—4月流感爆發(fā)期間44例流感病毒感染患者及同期55名體檢健康者的外周血中表面受體NKG2D及一系列細(xì)胞因子的表達(dá)變化，旨在了解流感患者機(jī)體免疫狀態(tài)的變化，方便臨床對(duì)疾病的早期診療，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情同意，選取該院流感爆發(fā)期間共44例臨床診斷為流感病毒感染的門診患者作為疾病組，其中男性18例，女性26例；年齡16～63歲，平均年齡（31.91±1.93）歲。選取同期55名體檢健康者作為對(duì)照組，其中男性26名，女性29名；年齡21～65歲，平均年齡（31.55±1.42）歲。采集兩組EDTΑ抗凝的新鮮外周血2 mL和對(duì)應(yīng)血清2 mL，進(jìn)行WBC及五分類計(jì)數(shù)，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+、NKG2D及細(xì)胞因子表達(dá)水平的檢測(cè)。

1.2 主要儀器與試劑

①WBC五分類:采用希森美康XN-B3進(jìn)行檢測(cè)，試劑購(gòu)自希森美康；②CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+、NKG2D、細(xì)胞因子：使用BECMAN公司的FC500流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+及溶血素試劑購(gòu)自北京同生時(shí)代；NKG2D試劑購(gòu)自BD公司；細(xì)胞因子購(gòu)自青島瑞斯凱爾生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WBC五分類 使用半導(dǎo)體激光流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合核酸熒光染色技術(shù)。

1.3.2 淋巴細(xì)胞亞群分析及NKG2D的檢測(cè) 分別使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體組合1（CD45PC7、CD4FITC/CD8PE/CD3PC5）和組合2（CD3FITC/CD16+56PE、NKG2DPC5.5）對(duì)研究對(duì)象外周全血進(jìn)行染色，組合2另設(shè)對(duì)照管（管內(nèi)不加入NKG2DPC5.5標(biāo)記，其余制備方法完全相同）。取50μl EDTΑ抗凝血，室溫避光15 min，加入經(jīng)10倍稀釋的免洗溶血素500μl，室溫避光15 min，樣本溶血充分后使用流式細(xì)胞儀FC500檢測(cè)，使用CXP Cytometer軟件進(jìn)行分析。

細(xì)胞亞群設(shè)門策略：組合1中T1為白細(xì)胞群，以T1為門，定義CD3+為T細(xì)胞群（T2），再以T2為門，分別定義出CD3+CD4+T細(xì)胞群（T3）和CD3+CD8+T細(xì)胞群（T4），見(jiàn)圖1；組合2中N1為白細(xì)胞群，以N1為門，定義CD3-CD16+56+細(xì)胞為NK（N2）和CD3+CD16+56+細(xì)胞為NKT（N3），最終分析NK其表面活化性相關(guān)受體NKG2D表達(dá)的百分含量，見(jiàn)圖2。

圖1 組合1淋巴細(xì)胞亞群分析方案

圖2 組合2淋巴細(xì)胞亞群分析方案

1.3.3 細(xì)胞因子檢測(cè) 兩組血液標(biāo)本采集30 min后，4 000 rpm離心5 min，取25μl樣本，分別加入25μl實(shí)驗(yàn)緩沖液、25捕獲微球檢測(cè)抗體、25μl檢測(cè)抗體，避光震蕩2 h后加入25μl染料，避光震蕩30 min。加10×洗滌液300μl，300～400 g常溫離心5 min，使用流式細(xì)胞儀FC500進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理數(shù)據(jù)，采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性，正態(tài)分布的計(jì)量資料使用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)（M）和四分位數(shù)間距（M25，M75）表示，組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 疾病組與對(duì)照組性別、年齡及WBC水平比較

將疾病組與對(duì)照組年齡、性別和WBC水平分別進(jìn)行K‐S檢驗(yàn)，其中性別、WBC呈正態(tài)分布（P＞0.05），年齡呈非正態(tài)分布（P＜0.05）。正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，疾病組與對(duì)照組年齡、性別及WBC水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 疾病組與對(duì)照組WBC水平比較

2.2 疾病組與對(duì)照組WBC五分類計(jì)數(shù)水平比較

在兩組WBC對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基礎(chǔ)上，對(duì)WBC進(jìn)行五分類計(jì)數(shù)，將疾病組與對(duì)照組分類計(jì)數(shù)水平分別進(jìn)行K-S檢驗(yàn)，其中單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞呈正態(tài)分布（P＞0.05），進(jìn)行t檢驗(yàn)；中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞呈非正態(tài)分布（P＜0.05），使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，兩組中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 疾病組與對(duì)照組WBC五分類計(jì)數(shù)水平比較

2.3 疾病組與對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平比較

在正常WBC分類中，單核細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞所占比例不超過(guò)10%，淋巴細(xì)胞占20%～50%，故使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果進(jìn)行再一步分析，除CD3+CD16+56+呈非正態(tài)分布（P＜0.05），其余指標(biāo)均呈正態(tài)分布（P＞0.05）。檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)兩組CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD16+CD56+差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而NKG2D表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.670,P=0.001），見(jiàn)表3。

表3 疾病組與對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平比較

2.4 疾病組與對(duì)照組細(xì)胞因子表達(dá)水平比較

細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)、炎癥應(yīng)答等生理和病理過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用，使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)水平進(jìn)行分析，檢測(cè)數(shù)據(jù)均呈非正態(tài)分布，使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)兩組IL-17和TNF-α差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而除此之外的其他細(xì)胞因子差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 疾病組與對(duì)照組細(xì)胞因子表達(dá)水平比較[M（M25，M75），pg/mL]

3 討論

流感病毒主要通過(guò)空氣中的飛沫、易感者與感染者之間的接觸或與被污染物品的接觸進(jìn)行傳播，一般秋冬季節(jié)是高發(fā)期。人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的。人群普遍易感，潛伏期長(zhǎng)短取決于侵入的病毒量和機(jī)體的免疫狀態(tài)，發(fā)病率高，病死率低，多以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主[8-9]，這與該研究結(jié)果兩組單核及淋巴細(xì)胞對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果相一致。

該研究中，兩組CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞亞群之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），疾病組各淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)略低于對(duì)照組,提示機(jī)體抗病毒能力的下降，但流感病毒感染后，病毒感染進(jìn)展過(guò)程中存在適應(yīng)性免疫受損，T細(xì)胞亞群能通過(guò)相互影響、相互調(diào)節(jié)、相互制約保持動(dòng)態(tài)平衡，這可能與非重癥有關(guān)[10]。CD3、CD4、CD8是T細(xì)胞受體識(shí)別外來(lái)抗原的輔助分子,表達(dá)這些分子的淋巴細(xì)胞是抗病毒免疫的重要組成部分,這些細(xì)胞數(shù)量的減少提示CD3、CD4、CD8是常見(jiàn)的T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物。CD3+CD4+細(xì)胞亞群能分泌細(xì)胞因子增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的抗感染機(jī)制和直接誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞免疫起正調(diào)節(jié)作用；CD3+CD8+細(xì)胞亞群主要為抑制性T細(xì)胞，抑制機(jī)體免疫應(yīng)答，也對(duì)靶細(xì)胞具有一定殺傷作用，對(duì)細(xì)胞免疫起負(fù)調(diào)節(jié)作用。當(dāng)不同的T淋巴細(xì)胞亞群在數(shù)量上和功能上發(fā)生異常時(shí)，即可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂。

疾病組NKG2D表達(dá)水平與對(duì)照組相比呈下調(diào)趨勢(shì)[(54.345±24.593）vs（69.398±13.003）]，這符合流感病毒逃避NK細(xì)胞的殺傷效應(yīng)[11]?；颊甙l(fā)生流感感染后，固有和適應(yīng)性免疫細(xì)胞均參與介導(dǎo)宿主對(duì)病毒感染的免疫反應(yīng)[12]。自然殺傷細(xì)胞（NK）是固有免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，能有效地殺滅病毒感染的細(xì)胞，進(jìn)而控制病毒感染。NK細(xì)胞作用于流感病毒的同時(shí)，有研究證明了流感病毒也具有反擊機(jī)制，主要通過(guò)直接誘導(dǎo)NK細(xì)胞凋亡、通過(guò)抑制性受體抑制NK細(xì)胞活化、抑制NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α等不同的機(jī)制作用于NK細(xì)胞，影響NK細(xì)胞發(fā)揮殺傷功能，形成有效感染[13]。CD16+CD56+是NK細(xì)胞的表面標(biāo)志，與T細(xì)胞淋巴亞群相似，可能由于NK細(xì)胞的殺傷和免疫逃逸作用[14]，兩組數(shù)據(jù)CD16+CD56+淋巴細(xì)胞水平之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NKG2D是NK細(xì)胞表面重要的活化性受體，與配體結(jié)合后可激活NK細(xì)胞和CD8+效應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生抗病毒干擾素IFN-γ發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，殺死被流感病毒感染的上皮細(xì)胞[15]。NKG2D還可作為協(xié)同刺激因子傳遞第二信號(hào)，增強(qiáng)其他活化性受體對(duì)NK細(xì)胞的激活作用[16]。

T淋巴細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化為Th1，Th2，Th17，分泌產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子，Th1產(chǎn)生IL-2、IL-8、IL-12、TNF-α和IFN-γ，促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)；Th2分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、TNF-α，誘導(dǎo)B細(xì)胞的活化和分化；Th17產(chǎn)生IL-17及TNF-α，免疫功能的紊亂勢(shì)必影響細(xì)胞因子表達(dá)水平的改變。流感病毒感染人體后,可以誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴,導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)[17]。該研究結(jié)果顯示，疾病組與對(duì)照組相比，除IL-17及TNF-α差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義之外，其他細(xì)胞因子水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該研究中IL-17檢測(cè)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在既往研究中IL-17對(duì)甲型與非甲型流感病毒感染相關(guān)肺炎患者具有較高的診斷靈敏度和特異性[18]，但在臨床感染中通常存在甲流乙流的混合感染，故單獨(dú)檢測(cè)IL-17意義不大。流感病毒感染時(shí)血清中IL-8明顯低于正常對(duì)照組，可能跟IL-8水平的變化能夠敏感地反映病情嚴(yán)重程度有關(guān)[19]。

該研究中，疾病組IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12P70及IFN-α、IFN-γ水平則明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），這與楊艷娥等[20]研究結(jié)果相符。在其研究中分析呼吸道感染的熱性驚厥患兒IL-6、IL-10水平表達(dá)，結(jié)果顯示感染組患兒IL-6水平（27.70±8.74）ng/L及IL-10（2.15±0.55）ng/L顯著高于健康對(duì)照組患兒（4.46±1.10）ng/L、（6.37±1.76）ng/L（P＜0.001）。于濤等[21]在其研究中對(duì)呼吸道感染患者進(jìn)行炎性細(xì)胞因子分析發(fā)現(xiàn)呼吸道病毒感染組TNF-α為（39.2±2.5）顯著高于無(wú)感染對(duì)照組（16.6±2.3）（P＜0.001）。IL-4、IL-5是Th2細(xì)胞分泌的特異性細(xì)胞因子，兩者都能夠刺激嗜酸性粒細(xì)胞活化、增殖、分化、移行，進(jìn)而分泌多種炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)[22]。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞及活化的單核細(xì)胞分泌，為炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子，是機(jī)體損傷期間宿主反應(yīng)最早、最強(qiáng)的介質(zhì)之一，在重癥炎癥反應(yīng)中高表達(dá)，同時(shí)亦可對(duì)機(jī)體免疫功能產(chǎn)生抑制作用[23]。章海峻等[9]的研究顯示甲型/乙型流感患者血清IL-2、IL-6、IL-10水平明顯高于對(duì)照組（H=10.43、6.78、114.26、67.43，P＜0.05）；同樣的結(jié)果在其他研究中也有報(bào)導(dǎo)，王海等[24]研究顯示流感病毒感染后,外周血中IL-12上升，其研究中流感組的IL-12水平高達(dá)（134.2±42.8）ng/L，顯著高于健康對(duì)照組（96.2±36.9）ng/L（P＜0.05）。IL-6是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)中最敏感、最重要的一種標(biāo)志物，T細(xì)胞、B細(xì)胞及活化的單核細(xì)胞都能在不同條件下產(chǎn)生IL-6，具有促進(jìn)和抑制炎癥反應(yīng)的免疫代償作用，對(duì)維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)有重要作用[25]。IL-6是目前臨床運(yùn)用較廣泛的炎癥指標(biāo)，檢測(cè)便捷。血清IL-6水平和流感嚴(yán)重程度之間有著緊密的關(guān)系，同時(shí)也會(huì)影響到患者的預(yù)后[26]，因此如何在短時(shí)間內(nèi)改善IL-6水平是臨床重要的治療方向[27]。該研究顯示，流感患者血清TNF-α水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因可能與流感產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)較輕有關(guān)。

綜上所述，流感患者外周血淋巴細(xì)胞上NKG2D表達(dá)水平降低，IL-8水平低于對(duì)照組，IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12P70及IFN-α、IFN-γ水平則明顯高于對(duì)照組，這對(duì)患者機(jī)體免疫功能的狀態(tài)、病情評(píng)估有一定臨床價(jià)值，可以作為診斷及監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的有效指標(biāo)，為流感的預(yù)防、診斷及治療提供一定的幫助。該文闡明了疾病發(fā)生后不同細(xì)胞亞群之間的相關(guān)性，為流感感染的診斷、治療和新型疫苗的研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。