吳 凱,覃業(yè)優(yōu),蔣立文,,周 輝,鄧放明,李 跑,王蓉蓉
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院,湖南 長沙 410128;2.食品科學與生物技術(shù)湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410128;3.湖南壇壇香食品科技有限公司,湖南 長沙 410300)
辣椒(Capsicum annuumL.)原產(chǎn)于拉丁美洲和北美后傳入我國[1]。辣椒營養(yǎng)價值高,富含VC。辣椒的主要規(guī)模種植地在陜西、河北、河南、云南、海南等地區(qū),嗜辣人群集中在湖南、湖北、江西、四川、重慶、貴州等區(qū)域,湖南辣椒產(chǎn)量約占全國5%,但消費量達到全國總量的10%[2]。剁辣椒是湖南地方特色調(diào)味料產(chǎn)業(yè)之一,剁辣椒的生產(chǎn)一般是在新鮮辣椒產(chǎn)地進行腌漬處理后,將腌漬后的辣椒運輸至湖南進行加工而成,所以新鮮辣椒產(chǎn)地預處理是品質(zhì)安全保障的重要環(huán)節(jié)之一[3-4]。
剁辣椒是發(fā)酵辣椒制品的典型代表,辣椒的辣味、脆度、色澤以及特殊發(fā)酵風味是剁辣椒品質(zhì)的4 個主要元素,既可直接食用,又是調(diào)味佳品[5]。工業(yè)化生產(chǎn)剁辣椒是將新鮮線椒品種在產(chǎn)地進行預處理獲得鹽胚(食鹽質(zhì)量分數(shù)20%左右保存)。發(fā)酵成熟后,進行脫鹽、調(diào)味、殺菌處理后成為產(chǎn)品??紤]產(chǎn)品市場消費者對辣味的需求,一般采用微辣的線椒作為主要加工原料,對于嗜辣人群通過配比一定比例朝天椒、艷紅辣椒等品種提升產(chǎn)品辣度,但此類品種水分含量比較低,所以需要采用不同腌漬方式進行處理以滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。
目前對辣椒及其制品的風味成分分析的主流方法是氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)法[6-8],但是該方法對同分異構(gòu)體跟極性相近的物質(zhì)分辨率較差,且對低保留指數(shù)(retention index,RI)和痕量物質(zhì)的靈敏度較低。氣相離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectroscopy,GC-IMS)是近年來出現(xiàn)的一種新型氣相分離和檢測技術(shù)[9-10],具有高靈敏度、高分辨率、操作簡便、分析高效等特點,特別適合于一些揮發(fā)性有機化合物的痕量檢測[11-15]。目前使用二維GC-IMS數(shù)據(jù)的化學計量學技術(shù)進行的食品風味研究已經(jīng)大大增加,如主成分分析(principal components analysis,PCA)、主題生成模型(latent dirichlet allocation,LDA)、K最近鄰算法(K-nearest neighbor,K-NN)、偏最小二乘(partial least-squares,PLS)法。這些方法為GC-IMS在食品風味化學中的應用提供了重要的貢獻[16]。目前國內(nèi)外將GC-IMS用于食品檢測分析主要集中于植物油工藝[17]、植物油種類鑒別及摻假檢測[18-19]、菌類風味成分[20]、鮮凍肉品貯藏時間及解凍方式判別[21-22]、減肥類保健食品檢測[23]、水產(chǎn)品風味[24-25]等方面,而GCIMS應用于辣椒醬方面的報道甚少[26]。
基于上述問題,本研究以艷紅辣椒為研究對象,采用6%、9%、12%、15%、18%五個梯度質(zhì)量分數(shù)食鹽對艷紅辣椒進行腌漬,探討分析腌漬1 a艷紅辣椒的主要理化及風味變化,旨在為優(yōu)化辣度較高、水分含量較低的辣椒品種標準化生產(chǎn)剁辣椒提供參考。
腌漬辣椒坯:來源于湖南壇壇香食品科技有限公司山東曹縣辣椒基地,辣椒品種為艷紅辣椒,食鹽質(zhì)量分數(shù)為6%、9%、12%、15%、18%,每袋20 kg,采用食品級袋包裝,外套黑色塑料袋遮光保存1 a。
亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、對氨基苯磺酸、氫氧化鈉、無水乙醇、硝酸銀、鄰苯二甲酸氫鉀(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;硼酸鈉(分析純) 廣東光華科技股份有限公司;甲醇、濃硫酸、鉻酸鉀(均為分析純)天津市光復科技發(fā)展有限公司;鹽酸奈乙二胺、酚酞(均為分析純) 天津市化學試劑研究所有限公司;草酸、乙酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸(標準品純度≥99.9%) 上海源葉生物科技有限公司。
Flavour Spec?GC-IMS聯(lián)用儀 德國G.A.S.公司;液相色譜儀 日本島津公司;CP114電子天平 奧豪斯儀器有限公司;KQ3200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UV-2450分光光度計、FE20K pH計梅特勒-托利多儀器有限公司;TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;磁力攪拌機、20133419超純水機 貝徠美生物科技有限公司;HWS-28電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司。
1.3.1 感官評價法評定腌漬辣椒
挑選10 名熟悉感官評價流程的食品專業(yè)學生,相關(guān)人員保持一定距離,禁止相互交談商議。根據(jù)表1感官評價標準,分別對5種不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒的色澤、脆度、香氣、滋味4 個指標進行感官評分。在感官質(zhì)量評定中,色澤權(quán)重占20%,脆度權(quán)重占30%,香氣權(quán)重占30%,滋味權(quán)重占20%,最終評分按照對應的權(quán)重占比計算綜合得分。
表1 腌漬辣椒感官質(zhì)量評定標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of pickled pepper
1.3.2 總酸、食鹽質(zhì)量分數(shù)和氨基酸態(tài)氮含量的測定
總酸含量:GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[27];食鹽質(zhì)量分數(shù):GB 5009.42—2016《食鹽指標的測定》[28];氨基酸態(tài)氮含量:GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[29]。
1.3.3 高效液相色譜法測定有機酸含量
1.3.3.1 色譜條件
流動相:甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀(3∶97,V/V),磷酸二氫鉀用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后使用;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長210 nm;進樣量10 μL。
1.3.3.2 標準曲線的繪制
利用電子天平精確稱取草酸18 mg(精確到0.000 1 g),蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸各300 mg(精確到0.000 1 g),用甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀(3∶97,V/V)的溶液溶解并定容至50 mL容量瓶,得到草酸質(zhì)量濃度為0.36 mg/mL,蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸質(zhì)量濃度為6 mg/mL;酒石酸質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL,用流動相分別將其稀釋2、4、6、8、10、12 倍,得到不同質(zhì)量濃度的有機酸標準溶液,經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾2 mL進樣瓶中,進行分析。以有機酸質(zhì)量濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線。
1.3.3.3 樣品處理
利用電子天平準確稱取5.00 g樣品,100 mL容量瓶定容,接著放置于75 ℃水浴鍋提取20 min,冷卻至室溫過濾,濾液經(jīng)0.45 μm水系膜過濾,最后進樣分析。
1.3.4 GC-IMS法測定揮發(fā)性物質(zhì)
1.3.4.1 樣品處理
取樣品1.0 g置于20 mL頂空瓶中待分析。
1.3.4.2 頂空進樣條件
頂空進樣體積500 μL;孵化時間15 min;孵化溫度40 ℃。
1.3.4.3 GC-IMS分析條件
分析時間:30 min;色譜柱類型:FS-SE-54-CB-0.5(15 m×0.53 mm);柱溫:60 ℃;載氣/漂移氣:高純氮氣(純度≥99.999%);IMS溫度:45 ℃;漂移氣流量:150 mL/min;載氣流量:0~2 min,2 mL/min;2~10 min,2~10 mL/min;10~20 min,10~120 mL/min;20~30 min:120~130 mL/min。
1.3.4.4 分析軟件
儀器配套的分析軟件包括LAV(Laboratory Analytical Viewer)和三款插件以及GC×IMS Library Search,可以分別從不同角度進行樣品分析。LAV:用于查看分析譜圖,圖中每一個點代表一種揮發(fā)性有機物;對其建立標準曲線后可進行定量分析;Reporter插件:直接對比樣品之間的譜圖差異;Gallery Plot插件:指紋圖譜對比,直觀且定量地比較不同樣品之間的揮發(fā)性有機物差異;Dynamic PCA插件:動態(tài)PCA,用于將樣品聚類分析,以及快速確定未知樣品的種類;GC×IMS Library Search;應用軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫可對物質(zhì)進行定性分析,可根據(jù)需求利用標準品自行擴充數(shù)據(jù)庫。
每次樣品均采用重復3 次,結(jié)果采用SPSS 26.0軟件處理數(shù)據(jù),顯著性分析采用最小顯著差異法。
2.1.1 不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒的感官評價
對5種質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬艷紅辣椒的色澤、脆度、香氣及滋味進行感官評價,結(jié)果如表2所示。6%~15%質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒的色澤評分具有顯著差異(P<0.05),食鹽質(zhì)量分數(shù)越高色澤評分越高,最低評分6.06,最高評分8.24,原因是高質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬會抑制微生物生長,腌漬辣椒沒有被腐蝕。脆度評分也是隨著鹽含量的增加而增加,最低5.12,最高8.33,表明在食鹽質(zhì)量分數(shù)低的環(huán)境下,辣椒中的微生物活動產(chǎn)生的果膠酶,導致辣椒在腌漬過程中組織軟化,脆度降低。5種質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬的辣椒在香氣與滋味評分方面都具有顯著差異(P<0.05),食鹽質(zhì)量分數(shù)為6%、15%、18%腌漬辣椒評分較低,表明食鹽質(zhì)量分數(shù)較低或者較高對腌漬辣椒的香氣及滋味都會有影響。食鹽質(zhì)量分數(shù)為12%腌漬辣椒香氣和滋味評分最高,分別為9.38和8.33,并且綜合評分最高也是食鹽質(zhì)量分數(shù)12%腌漬的辣椒,得分為8.51。
表2 不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒感官評分結(jié)果Table 2 Sensory scores of pickled peppers with different salt contents
2.1.2 不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒總酸含量的變化
總酸含量反映了腌漬剁辣椒中酸味物質(zhì)含量,決定剁辣椒的酸味特性。由圖1可知,隨著腌漬辣椒食鹽質(zhì)量分數(shù)的增加,腌漬辣椒中總酸含量逐漸下降,因為食鹽質(zhì)量分數(shù)高會抑制乳酸菌的發(fā)酵,導致酸味物質(zhì)產(chǎn)量下降,從而導致總酸含量的下降。5種不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒總酸含量分別為(5.431±0.014)、(4.575±0.009)、(4.227±0.012)、(4.125±0.013)、(3.882±0.005)g/kg,不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬的辣椒之間總酸差異顯著(P<0.05)。食鹽質(zhì)量分數(shù)為6%的腌漬辣椒總酸含量最高,與其他質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒間差異顯著(P<0.05),食鹽質(zhì)量分數(shù)為18%的腌漬辣椒總酸含量最少,與其他質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒總酸含量之間有顯著性差異(P<0.05),其結(jié)果與歐陽晶等[30]研究結(jié)果一致。
圖1 不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒總酸的含量Fig.1 Changes in total acid content in pickled pepper with different salt contents
2.1.3 不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒氨基酸態(tài)氮含量的變化
腌漬辣椒中氨基酸態(tài)氮含量反映了鮮物質(zhì)的多少,決定剁辣椒的鮮味。由圖2可知,隨著食鹽質(zhì)量分數(shù)的增加,腌漬辣椒中氨基酸態(tài)氮的含量逐漸減少,原因是高鹽會抑制微生物的生長,同時也抑制水解酶的水解反應。5種不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)分別為(0.165 5±0.000 5)%、(0.128 5±0.001 2)%、(0.086 2±0.000 8)%、(0.056 3±0.001 0)%、(0.033 6±0.000 5)%,不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬的辣椒之間氨基酸態(tài)氮含量差異顯著(P<0.05)。在食鹽質(zhì)量分數(shù)為6%的腌漬辣椒中氨基酸態(tài)氮含量最高,與其他食鹽質(zhì)量分數(shù)腌漬辣椒有顯著差異(P<0.05),在食鹽質(zhì)量分數(shù)為18%的腌漬辣椒中氨基酸態(tài)氮的含量,也與其他質(zhì)量分數(shù)食鹽之間有顯著差異(P<0.05)。
圖2 不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒氨基酸態(tài)氮的含量Fig.2 Changes in amino nitrogen content in pickled pepper with different salt contents
2.1.4 不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬的辣椒有機酸含量的變化如圖3所示,可以看出方法具有較好分離效果。
圖3 6種標準有機酸的色譜圖Fig.3 Chromatogram of a mixture of six organic acid standards
將6種不同質(zhì)量濃度的混合有機酸從低到高依次進樣,采用外標法定量,根據(jù)各種有機酸的峰面積與濃度之間的關(guān)系進行線性回歸,得方程見表3。
表3 6種不同有機酸的標準曲線Table 3 Calibration curve equations for determination of six organic acids
從表3可知,在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi),得出的各有機酸的標準曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.999,線性相關(guān)可滿足線性分析要求。
根據(jù)各有機酸的線性回歸曲線,再根據(jù)每個樣品的色譜圖中峰面積和出峰時間,可以計算出樣品中有機酸的含量。
從表4可以得出,隨著食鹽質(zhì)量分數(shù)的增加,有機酸含量不斷減少,因為食鹽質(zhì)量分數(shù)高抑制微生物生長。其中草酸含量在5種質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒中最高,酒石酸含量最少,在12%以上質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬的辣椒中未檢測出,可能原因是物質(zhì)中沒有酒石酸或者被其他物質(zhì)干擾無法檢測,賈洪鋒等[31]研究也表明腌漬辣椒中酒石酸未檢測出,可能是由于樣品中含量少或者是草酸影響了酒石酸的檢測。
表4 不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒中有機酸的含量Table 4 Contents of organic acids in pickled pepper with different salt contents μg/g
圖4中標識的6%-4、9%-4、12%-4、15%-4、18%-4分別表示5種質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬艷紅辣椒的GC-IMS二維圖譜。整個圖的背景為深藍色,反應離子峰右側(cè)箭頭所指為乙醇峰,乙醇濃度較高會拖尾成條狀。反應離子峰兩側(cè)的每一個點代表一種揮發(fā)性有機物,顏色越深代表濃度越大,白色表示濃度低,紅色表示濃度高。從圖4可以看出,5種質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒之間的揮發(fā)性物質(zhì)有差異性。如圖5所示,以最左側(cè)6%-4為參照,其他幾張圖譜中濃度相同的物質(zhì)顏色抵消為白色。被參比樣品中的藍色區(qū)域表示該物質(zhì)濃度低于參比樣品,藍色越深,表示濃度越低;被參比樣品中的紅色區(qū)域表示該物質(zhì)濃度高于參比樣品,紅色越深,表示濃度越高。圖5以6%質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒的圖譜為參照,可以明顯看出食鹽質(zhì)量分數(shù)在12%以上的腌漬辣椒揮發(fā)性物質(zhì)更多,與9%質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬的辣椒有明顯差異。其中紅色箭頭表示揮發(fā)出的乙醇,腌漬辣椒食鹽質(zhì)量分數(shù)越高,揮發(fā)出的乙醇越多,這與趙馳等[32]研究結(jié)果一致,究其原因可能是在食鹽質(zhì)量分數(shù)較高的環(huán)境下腌漬辣椒中部分微生物代謝活動受到抑制,而酵母菌可以在高滲透環(huán)境下通過HOP-MAP激酶的誘導并級聯(lián)提高膨壓劑甘油的水平,從而導致一系列滲透適應反應產(chǎn)生了乙醇[33]。
圖4 不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒的GC-IMSFig.4 GC-IMS spectra of pickled peppers with different salt contents
圖5 不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒的GC-IMS差異圖Fig.5 GC-IMS spectra showing difference in volatile composition of pickled peppers with different salt contents
從表5可知,5種質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒中共檢測出61種揮發(fā)性物質(zhì),其中酯類22種、醛類11種、醇類9種、酸類9種、酮類6種、其他物質(zhì)4種。酯類種類最多,是發(fā)酵過程中酸跟醇反應產(chǎn)生的,賦予腌漬辣椒獨特的香味。其中乙酸異戊酯具有強烈的香蕉、生梨、蘋果的甜水果香氣,并帶有梨的甜酸味,周曉媛等[34]在自然發(fā)酵辣椒中也檢出了類似的氣味物質(zhì),酯類物質(zhì)對腌漬辣椒的香氣具有十分重要的影響。醛類物質(zhì)風味閾值較低,但也是辣椒揮發(fā)性物質(zhì)的重要組成成分,醛類物質(zhì)的香氣能夠作用于感官使香氣更為明顯,從腌漬辣椒中測出醛類物質(zhì)具有11種,大大提高了腌漬辣椒的香氣。9種醇類物質(zhì)主要來源于酵母菌等微生物降解糖類或者辣椒原料得到,在不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒中醇類物質(zhì)含量及種類不同,醇類常賦予產(chǎn)品新鮮的氣味,也是生成重要的風味物質(zhì)酯類的主要來源[35],酸類物質(zhì)是腌漬辣椒過程中的重要產(chǎn)物,主要來源于乳酸發(fā)酵,獨特的酸味是香味的主要組成部分。
續(xù)表5
為了更加全面地對比不同樣品間揮發(fā)性有機物組分的差異,可選取譜圖中所有的待分析峰,自動生成指紋圖譜,結(jié)果如圖6所示。
從圖6可以看出,每種樣品的完整揮發(fā)性有機物信息以及樣品之間揮發(fā)性有機物的差異。觀察圖6指紋圖譜再結(jié)合表5,由圖6A、E區(qū)域可知:腌漬辣椒食鹽質(zhì)量分數(shù)為6%和9%時乳酸乙酯、DL-白氨酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丁酯、4-羥基丁酸內(nèi)酯、甲乙酮、異丁醇、2-庚酮、苯甲醛、異戊醛、2-乙?;邕虻蕊L味物質(zhì)釋放的非常多,隨著食鹽質(zhì)量分數(shù)增加,這些物質(zhì)的釋放量減少。由圖6B、D區(qū)域可以得知:隨著食鹽質(zhì)量分數(shù)增加,腌漬辣椒釋放出的己酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、丙酸乙酯、己酸乙酯、苯乙醛、3-甲基戊酸、3-甲基-3-丁烯-1-醇、2-甲基丁酸乙酯、2-辛醇、3-甲基-1-戊醇、正戊醇、2,3-丁二酮、3-戊酮、2-戊基呋喃等風味物質(zhì)會逐漸增多,隨著這些物質(zhì)的增加,使腌漬后的辣椒更加具有風味,口感更佳。由圖6C區(qū)域可知,丁酸丁酯、戊酸乙酯、丁酸、(E)-2-庚烯醛這些風味物質(zhì)基本上只存在于食鹽質(zhì)量分數(shù)為12%的腌漬辣椒中。
圖6 不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜Fig.6 Volatile fingerprints of pickled peppers with different salt contents
如圖7所示,PC1貢獻率為50%,PC2貢獻率為20%,累計貢獻率達到70%,表明這兩個PC能夠代表原始數(shù)據(jù)的絕大部分有效信息,分析所得數(shù)據(jù)能夠反映出不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒的總體特征[36]。5種質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒很好地分布在5 個區(qū)域,表明它們之間的揮發(fā)性物質(zhì)存在明顯差異。其中食鹽質(zhì)量分數(shù)為12%、15%、18%腌漬辣椒的主要差異在PC2,食鹽質(zhì)量分數(shù)為6%、9%、15%腌漬辣椒的主要差異在PC1。
圖7 不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒PCA結(jié)果Fig.7 PCA plot discriminating pickled peppers with different salt contents
根據(jù)5種不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒的感官評定結(jié)果分析,食鹽質(zhì)量分數(shù)為6%腌漬辣椒的色澤、脆度、香氣及滋味評分都較低,食鹽質(zhì)量分數(shù)為15%以上腌漬辣椒的香氣及滋味評分也較低。測定5種不同質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬辣椒的總酸、氨基酸態(tài)氮以及有機酸含量,從結(jié)果得出食鹽質(zhì)量分數(shù)較低的腌漬辣椒總酸、有機酸以及氨基酸態(tài)氮含量高,低食鹽質(zhì)量分數(shù)環(huán)境乳酸發(fā)酵不能很好地被抑制,且微生物生長不能被抑制導致總酸跟氨基酸態(tài)氮的增加。根據(jù)GC-IMS檢測結(jié)果分析,在低質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬的辣椒中,揮發(fā)性成分少,導致香味不佳,可能與總酸較高有關(guān),食鹽質(zhì)量分數(shù)高腌漬的辣椒揮發(fā)性成分較多,香氣成分高。綜合分析后可以得出9%~12%質(zhì)量分數(shù)食鹽腌漬艷紅辣椒風味及品質(zhì)較好,可直接用于剁辣椒的加工調(diào)味,對辣椒加工具有一定的指導意義。