鄧高文，劉 洋,，李 跑，廖盧艷，尹含靚，蔣立文,，覃業(yè)優(yōu)，肖 何

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.湖南壇壇香食品科技有限公司，湖南 長沙 410300）

豆豉以大豆為原料，經(jīng)過浸泡、蒸煮、攤涼、制曲、發(fā)酵等一系列工藝制成的一種中國傳統(tǒng)調(diào)味副食品[1-3]。豆豉可分為曲霉型、毛霉型、細菌型等類型。國內(nèi)一般生產(chǎn)的細菌型豆豉主要是水豆豉，其中貴州水豆豉是一種地方特色的發(fā)酵豆制品，在貴州、湖南湘西、四川等地以涼拌食用為主。與其他發(fā)酵豆豉相比，產(chǎn)品生產(chǎn)周期較短，氣味特殊，滋味獨特。水豆豉一般在25～30 ℃進行自然發(fā)酵，發(fā)酵微生物以細菌為主，發(fā)酵后黃豆表面發(fā)白具有黏度絲狀物，經(jīng)過加入含有辣椒面、食鹽及其他香辛料的湯汁后繼續(xù)發(fā)酵成為一種特殊風味豆制品。

隨著Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，豆豉微生物菌落多樣性變化被廣泛研究[4-6]。李薇等[7]利用高通測序技術(shù)對制曲階段及后發(fā)酵階段永川毛霉型豆豉曲料中微生物的群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)演替規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在制曲階段發(fā)揮主導作用的有根霉屬、曲霉屬和芽孢桿菌屬（Bacillus），后發(fā)酵階段微生物菌落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化較大，但Bacillus具有較穩(wěn)定的相對豐度。趙文鵬等[8]依托高通量測序技術(shù)揭示曲霉型豆豉發(fā)酵中細菌群落組成和演替規(guī)律，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬是整個發(fā)酵過程的核心菌屬，發(fā)酵過程中細菌群落的組成變化明顯，還原糖含量、溫度和pH值可能是曲霉型豆豉細菌群落演替的推動因子。而目前對貴州水豆豉微生物的研究主要集中在優(yōu)勢均屬的分離純化，對其發(fā)酵過程中的微生物多樣性變化的相關研究不多。

本實驗以貴州水豆豉幾個主要發(fā)酵階段的微生物群落構(gòu)成為研究對象，用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對貴州水豆豉樣品中的細菌菌群結(jié)構(gòu)及多樣性變化規(guī)律進行研究，同時采用純培養(yǎng)分離鑒定法進行關鍵核心微生物鑒定，以期為貴州水豆豉標準化控制提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

貴州水豆豉發(fā)酵過程及后發(fā)酵的坯料，分別是黃豆蒸熟后冷卻到40 ℃后自然控制溫度28～32 ℃之間發(fā)酵24、48 h，以及后發(fā)酵放置24 h的產(chǎn)品（冷開水加入一定比例的干辣椒面、香辛料、12%～15%食鹽，產(chǎn)品最終平衡鹽度8%），取樣編號分別為DCFW1、DCFW2、DCFW3，來自貴州某企業(yè)。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

甲醛溶液 湖北奧生新材料科技有限公司；氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀 國藥集團化學試劑有限公司；酚酞溶液Phusion熱啟動Flex 2X預混液（Pusion Hot Start Flex 2X Master Mix） 上海儀濤生物儀器有限公司；DL2000 DNA Marker 日本TaKaRa公司；核酸定量分析試劑盒（Qubit dsDNA HS Assay Kit） 美國英杰生命技術(shù)有限公司；Biowest Agarose瓊脂糖G-10 法國Biowest公司；50×TAE 緩沖液 生工生物工程（上海）股份有限公司；AxyPre聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒 美國愛思進公司；RStool DNA試劑盒 美國Omega公司。

1.2 儀器與設備

JE 502電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；LDZX-50 KBS高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD無菌操作臺 蘇州凈化設備有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海飛越實驗儀器有限公司；CX23LEDRFS1C生物顯微鏡 奧林巴斯（廣州）工業(yè)有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；5424型常溫離心機 德國Eppendorf公司；Biocen 22 R冷凍離心機 德國Wiggens公司；WH-861型旋渦振蕩儀 太倉華利達實驗室設備公司；DK-8 D型三溫三控恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；A 200型PCR儀 杭州朗基科學儀器有限公司；MiSeq測序儀美國Illumina公司；EPS 300型電泳儀、Tanon-2500型凝膠成像儀 上海天能公司；DWHL 388型超低溫冷凍儲存箱 中科美菱低溫科技有限責任公司；水系微孔濾膜（Φ50 mm，孔徑0.22 μm） 海寧郭店桃園膜分離設備廠。

1.3 方法

1.3.1 豆豉16S rDNA高通量測序

1.3.1.1 豆豉樣品總DNA的提取

將貴州水豆豉（DCFW1、DCFW2、DCFW3）攪拌均勻后各取50 g，然后用孔徑為0.22 μm的水系微孔濾膜進行抽濾。將抽濾完成后的濾膜剪碎放入微型離心管中，按照R Stool DNA試劑盒說明書提取總DNA。

1.3.1.2 豆豉16S rDNA高通量測序方法

以豆豉總DNA為模板進行細菌16S rDNA V3-V4區(qū)域擴增。引物：338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。DNA模板50 ng、2×Taqmaster Mix 15 μL，正向和反向引物各1 μL，加入ddH2O定容至30 μL。充分混勻按以下程序進行PCR：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，5 個循環(huán)；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反應35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

取PCR產(chǎn)物10 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將檢測合格的樣品送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司進行高通量測序。

1.3.1.3 數(shù)據(jù)分析

對下機數(shù)據(jù)首先根據(jù)樣品的條形碼信息對數(shù)據(jù)進行拆分，再根據(jù)雙端序列的重疊關系將序列拼接成長的tags，并將序列上建庫引入的條形碼和引物序列去除。為了保證后續(xù)結(jié)果的可靠性，使用Vsearch（V2.3.4）軟件過濾去除長度小于100 bp的序列、含不確定堿基達5%以上的序列及嵌合體序列等低質(zhì)量序列[9]。再以平均鄰近聚類算法通過Verseach（V2.3.4）將具有97%以上相似性的序列劃分為同一個操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），挑選代表性序列使用[10]。在核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project，RDP）中進行序列比對，明確序列的分類地位。利用MAFFT（V 7.310）軟件對不同類群優(yōu)勢種群的差異進行多序列比對，研究不同OTU間的系統(tǒng)發(fā)育關系。同時，可根據(jù)每個OTU代表序列與RDP數(shù)據(jù)庫的比對，獲得各樣本的物種注釋結(jié)果，經(jīng)過分類統(tǒng)計后可得到各分類水平上物種的相對豐度信息。使用Verseach（V2.3.4）計算樣品的各項數(shù)據(jù)指標，通過α和β多樣性分析研究單個樣本中物種多樣性和多個樣本間菌群結(jié)構(gòu)的差異[11-12]。

1.3.2 發(fā)酵微生物的初步分離鑒定

取貴州水豆豉50 g（均勻取樣）于無菌燒杯中，置于90 ℃水浴鍋中加熱15 min后，取其中25 g作為檢測樣品。在無菌條件下，將檢測樣品25 g用滅菌過的生理鹽水配制10－1～10－10稀釋度的菌液，充分混合均勻[13-14]。采用涂布法分離主要耐熱微生物。將培養(yǎng)皿倒置于37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。對菌落進行形態(tài)鑒定，共發(fā)現(xiàn)31 株菌種（1～31），通過革蘭氏染色，共鑒定出9 株，分別命名：3、6、8、9、16、21、23、26、31。同時采用酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基對產(chǎn)蛋白酶的微生物進行鑒定，并觀察這些菌落的周圍透明圈形成情況，分別測量透明圈和菌落的直徑長短，計算之后比較比值大??；選取比值較大的菌株按照要求做革蘭氏染色實驗及鏡檢進行初步鑒定，確認所篩選菌株為芽孢桿菌后進行重復實驗，再編號比較比值大小[15]。

1.3.3 發(fā)酵微生物的鑒定

對酪蛋白培養(yǎng)2 次實驗結(jié)果進行記錄計算，在此基礎上選擇透明圈與單一菌落直徑比值較大的菌落，按照要求進行涂片后做革蘭氏染色實驗，顯微鏡下觀察，防止在第2次酪蛋白培養(yǎng)之后菌株受到污染而挑錯菌的情況發(fā)生。再選取以上所述革蘭氏陽性菌進行VITEK MS全自動微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

按照生物學樣品處理基本要求，所有樣品均有4 個生物學重復樣品。采用SPSS 18.0和Excel 2019進行數(shù)理統(tǒng)計分析和相關性分析[17-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種不同樣品的OTU統(tǒng)計及分類學分析

對測序獲得的296 063 條有效數(shù)據(jù)進行聚類分析，OTU聚類后3 組樣品中總共得到1 124 個OTU，根據(jù)3 組樣品中的OTU繪制Venn圖（圖1）。

圖1 3種樣品中的OTU分布圖Fig.1 Venn diagram showing distribution of bacterial OTUs in three douchi samples

由圖1可知，DCFW1中含有782 個OTU，DCFW2中含有676 個OTU，DCFW3中含451 個OTU。說明DCFW1和DCFW2的樣本多樣性較好，這可能是由于DCFW3經(jīng)過后發(fā)酵在食鹽和香辛料等的作用下微生物總數(shù)下降[19]。DCFW1和DCFW2樣品中相同的OTU有530 個，說明二者微生物種群具有極大的相似性。DCFW3和DCFW2樣品中相同的OTU僅221 個，這可能是由于拌料時引入的外界微生物的污染和食鹽的抑菌作用等導致。3種樣品共有的OTU為127 個，揭示這些微生物在發(fā)酵以及調(diào)味后的水豆豉中一直起重要的作用。

PCA（圖2）表明，PC1和PC2兩主軸解釋度和為89.13%，說明其已能夠反映樣品中大部分的信息，就樣品分布來看DCFW1、DCFW2相距較近，說明兩者菌群結(jié)構(gòu)相似，而DCFW3與DCFW1、DCFW2相距較遠，說明DCFW3在外界微生物的污染和加鹽等作用下，菌群結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯變化，這與圖1結(jié)果類似。

圖2 PCA結(jié)果Fig.2 PCA plot

2.2 3 個樣品的物種分類與注釋

將前面的OTU代表序列分別與NT-16S數(shù)據(jù)庫進行比對，得到各個樣本所有OTU的物種注釋。3 個樣品門水平的分類圖見圖3。3 個樣品一共注釋了6 個門類：厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍藻菌門（Cyanobacteria）、未知細菌類（bacteria_unclassified）。厚壁菌門在DCFW1、DCFW2、DCFW3中占絕對優(yōu)勢的菌種。變形菌門在DCFW2中含量最高，DCFW1次之、DCFW3最少。而擬桿菌門只有在DCFW1含有。隨著發(fā)酵時間的延長以及食鹽等香辛料的加入，產(chǎn)芽孢的厚壁菌門不斷增加，擬桿菌門、變形菌門等不斷減少。此外，從菌群結(jié)構(gòu)和豐富度看DCFW3與DCFW2和DCFW1差異較大，其中DCFW1含有的門類菌種最多。

芽孢桿菌屬和厚壁菌門是貴州水豆豉主要微生物[20]。由圖3可知，3 個樣品中的芽孢桿菌屬相對豐度分別為DCFW3（87.8%）＞DCFW2（64.36%）＞DCFW1（32.97%），沙雷氏菌屬（Serratia）可以發(fā)酵并利用麥芽糖，可產(chǎn)氣產(chǎn)色素[21]，但其只存在于DCFW1中（1.31%）。厚壁菌門豐度不斷增加、變形菌門不斷減少，尤其DCFW3階段，可能是拌料加鹽導致。從發(fā)酵各階段的分布看，細菌多樣性復雜程度不斷減弱。芽孢桿菌屬隨著發(fā)酵時間的延長，豐度不斷增加，雜菌不斷減少，這可能是隨著發(fā)酵曲溫達到50 ℃左右，適合嗜熱細菌的生長，而其他一些不耐高溫的微生物則被抑制。變形桿菌屬（Proteus）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）豐度也在不斷減少，可能由于拌料時鹽、香辛料等抑菌成分的加入所導致[22]。因芽孢桿菌屬為貴州水豆豉主要微生物且后期發(fā)酵曲溫較高，因此進行耐熱微生物分離鑒定實驗。

圖3 3 個樣品的門（a）、屬（b）水平分類Fig.3 Bacterial community composition of three douchi samples at the phylum (a) and genus (b) levels

2.3 耐熱微生物分離鑒定結(jié)果

2.3.1 革蘭氏染色實驗初步鑒定結(jié)果

革蘭氏染色實驗初步鑒定結(jié)果（圖4）顯示，第1次酪蛋白瓊脂培養(yǎng)后所篩菌株均在革蘭氏染色后均呈紫色，菌體較短且均有芽孢，因此初步判定所檢菌均為革蘭氏陽性芽孢桿菌。

圖4 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（×100）Fig.4 Microscopic examination of gram stained-isolates (× 100）

2.3.2 選擇性酪蛋白瓊脂篩選高蛋白酶活性微生物

通過對酪蛋白瓊脂實驗的篩選菌落進行質(zhì)地形態(tài)的觀察分析，可知3、9號，6、21和31號，8、16、23及28號各是同一種菌。結(jié)合第2次酪蛋白瓊脂實驗的結(jié)果，根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值，選擇（2）、（11）、（16）、（28）和（31）號進行VITEK MS微生物質(zhì)譜鑒定。

表1 酪蛋白瓊脂培養(yǎng)結(jié)果及菌落形態(tài)Table 1 Colonial morphology of isolates cultured on casein agar plates

2.3.3 VITEK MS微生物質(zhì)譜鑒定

經(jīng)VITEK MS全自動微生物質(zhì)譜鑒定（圖5）表明，（2）、（11）、（16）和（28）號均有枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和死谷芽孢桿菌4種可能。因該3種菌同屬枯草芽孢桿菌屬，在質(zhì)譜鑒定過程中的生化反應比較相似，且目前VITEK系統(tǒng)的鑒定只能達到屬水平，因此將該結(jié)果結(jié)合菌落形態(tài)分析確定菌株種類[23]。死谷芽孢桿菌一般從土壤中分離得到，因此從水豆豉分離出的可能不大?？莶菅挎邨U菌是納豆中主要微生物，屬于水豆豉發(fā)酵的優(yōu)勢菌株。蠟樣芽孢桿菌是致病菌[24]，說明在水豆豉自然發(fā)酵過程中存在安全風險。

圖5 VITEK MS全自動微生物質(zhì)譜鑒定圖Fig.5 Mass spectra of four strains with high protease activity identified by VITEK MS

3 討 論

豆豉獨特的感官風味和豐富的營養(yǎng)價值與參與發(fā)酵的微生物菌群結(jié)構(gòu)密切相關。由于豆豉制作多采用傳統(tǒng)工藝開放式生產(chǎn)，各地的氣候、原料、發(fā)酵工藝等區(qū)別，從而造就了其極具地方特色的特點。目前，已有研究者利用高通量測序技術(shù)對湖南[25]、江西[26]和甘肅[27-28]等地區(qū)豆豉的微生物多樣性進行了分析。然而，作為藥食兩用的貴州水豆豉，其微生物多樣性卻較少被關注。本研究利用高通量測序技術(shù)結(jié)合分離純化技術(shù)對貴州水豆豉進行細菌多樣性分析。結(jié)果表明：貴州水豆豉細菌組成較為豐富，主要以厚壁菌門、變形菌門和芽孢桿菌屬為主，含少量短芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬等。與甘肅[27-28]傳統(tǒng)水豆豉樣品厚壁菌門、變形菌門和芽孢桿菌屬均為優(yōu)勢菌種，而江西[26]未檢出，主要以葡萄球菌屬、乳桿菌為主。湖南瀏陽[25]樣品雖以厚壁菌門為主，但真菌更復雜，有乳桿菌屬、微球菌屬、腸桿菌屬等。

4 結(jié) 論

本實驗基于Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析貴州水豆豉中細菌多樣性，同時結(jié)合貴州水豆豉中耐熱性產(chǎn)蛋白酶微生物進行分離鑒定。在3 個樣品中共發(fā)現(xiàn)了在門水平共注釋了6 個門類，屬水平共分為21 屬類。厚壁菌門和芽孢桿菌屬是占絕對優(yōu)勢的菌，其次是變形菌門和變形桿菌屬。在整個發(fā)酵時期芽孢桿菌屬都隨著發(fā)酵時間的延長豐度不斷增加。利用VITEK技術(shù)從水豆豉中鑒定出4 株菌，分別為枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。其中，蠟樣芽孢桿菌具有致病性，說明在水豆豉自然發(fā)酵過程可能存在一定的安全隱患，還有待進一步研究。