王安琪 孔琳/延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系 133002

炎癥小體（inflammasome）存在于細(xì)胞內(nèi)，是一種由很多蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，分子量很大，約為700 KDa，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。目前的許多相關(guān)研究都表明，炎癥小體參與了宿主的防御反應(yīng)，其中，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（nucleotide binding oligomerzation domain like receptorprotein3，NLRP3）炎癥小體，參與多種抗寄生蟲感染的作用及調(diào)控機(jī)制，已成為多個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

新孢子蟲是一種細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，牛、羊等一些中間宿主感染新孢子蟲后會(huì)引起孕畜流產(chǎn)，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)的繁殖具有巨大的沖擊，同時(shí)也帶來了極大的經(jīng)濟(jì)損失。為進(jìn)一步探索NLRP3 介導(dǎo)的炎性小體反應(yīng)，本研究利用NLRP3 基因缺失小鼠深入研究NLRP3 炎性小體在抗新孢子蟲感染中的作用，為繼續(xù)探索NLRP3 基因的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞與蟲株新孢子蟲速殖子和Vero 均為本實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6 雌性小鼠，C57BL/6 雌性NLRP3，ASC 及caspase-1/11 基因缺失小鼠，均為6～8 周齡，體重20+4g，購(gòu)自于長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境：將小鼠置于25℃，濕度50%，獨(dú)立通風(fēng)的環(huán)境中喂養(yǎng)，定時(shí)定量給予鼠料并自由飲水。

1.3 試劑與藥品RPIM-1640 培養(yǎng)基、胎血清牛、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自吉林省盟創(chuàng)生物科技有限公司；0.22μm PVDF膜購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；小鼠IL-1β，IL-18，IFN-γ，ELISA 試劑盒購(gòu)自Sigma 公司。

2 方法

2.1 新孢子蟲的培養(yǎng)和純化參考楊慧珍的方法，從-80℃冰箱取出裝有蟲體的凍存管，立即放入37℃的水浴中，快速晃動(dòng)，待蟲體懸液完全融解后，移入已經(jīng)長(zhǎng)成單層的Vero 細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，通過顯微鏡，觀察細(xì)胞和蟲體的生長(zhǎng)狀態(tài)，間隔12h 換液一次，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和蟲體數(shù)量確定傳代時(shí)間。傳代培養(yǎng)20d 后，獲得足量的、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的蟲體備用。

2.2 分離Vero 細(xì)胞中的新孢子蟲蟲體參考玄學(xué)南的方法，在蟲體生長(zhǎng)達(dá)到旺盛時(shí)，倒掉舊的培養(yǎng)液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行潤(rùn)洗后，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，通過5.0μm 孔徑的微孔濾膜，濾液收于50mL 離心管，將濾過的蟲體懸液2000rpm 離心10min，棄去上清液，加入50mL 不含血清培養(yǎng)液仔細(xì)重懸蟲體，在顯微鏡下，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)蟲體個(gè)數(shù)，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 蟲體感染小鼠模型的建立用500μl PBS 重懸2×107新孢子蟲速殖子，然后進(jìn)行小鼠的腹腔接種，感染10d 后，對(duì)組織進(jìn)行采樣檢測(cè)；用500μl PBS 重懸1×107新孢子蟲速殖子，感染15d 后，對(duì)組織進(jìn)行采樣檢測(cè)。

2.4 蟲量檢測(cè)將小鼠處死之后，用1mL 冷PBS 反復(fù)充分的沖洗小鼠腹腔，將腹腔內(nèi)的灌洗液全部吸出，離心后，-20℃保存待用；分別取小鼠的心、肺和腦組織，加入液氮充分研磨，取100～200mg，用DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，進(jìn)行濃度測(cè)定后，-20℃保存待用；最后用絕對(duì)熒光定量PCR 檢測(cè)細(xì)胞組織中新孢子蟲的數(shù)量。

2.5 ELISA 檢測(cè)感染后的小鼠眼球采血，4℃靜置12h，將析出的血清8000g 離心10min，收集上清液，-20℃保存待用；將獲得的小鼠腹腔灌洗液離心取上清液，-20℃保存待用。稀釋樣品，用ELISA 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

2.6 數(shù)據(jù)處理用 Graphpad 軟件作圖，Student’s t 檢驗(yàn)用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 宿主被新孢子蟲感染后NLR P3 炎癥小體的保護(hù)作用為進(jìn)一步了解新孢子蟲感染誘導(dǎo)的NLRP3 炎癥小體反應(yīng)對(duì)宿主產(chǎn)生致病作用還是保護(hù)作用，將采用2×107新孢子蟲速殖子對(duì)小鼠進(jìn)行持續(xù)30d 的腹腔感染。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在感染第10d 時(shí)，對(duì)IL-1β 的分泌量進(jìn)行檢測(cè)，WT 及三種基因缺失小鼠的血清中均未見IL-1β（圖1A），但發(fā)現(xiàn)WT 小鼠血清中有較高水平的IL-18，而在ASC-/-，Caspase-1/11-/-小鼠中IL-18 的含量顯著減少，NLIP3-/-小鼠中IL-18 的分泌也存在降低趨勢(shì)，但無明顯差異（圖1B）。對(duì)小鼠的腦組織、心臟、肺組織的新孢子蟲數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，WT小鼠與NLIP 3-/-小鼠的蟲數(shù)無明顯差異，ASC-/-小鼠Caspase-1/11-/-小鼠腦組織中的數(shù)量與WT 小鼠相比明顯增多（圖1C）；ASC-/-小鼠和Caspase-1/11-/-小鼠心臟和肺組織中的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于WT 小鼠，但ASC-/-小鼠和Caspase-1/11-/-的數(shù)量沒有明顯差異（圖1D，E）。

圖1 NLRP3，ASC 和 caspase-1/11 在新孢子蟲感染中的作用

3.2 在新孢子蟲早期感染中NLR P3 炎癥小體介導(dǎo)細(xì)胞因子分泌宿主在感染新孢子蟲之后，NLRP3，ASC 和Caspase-1/11 可以誘導(dǎo)分泌IL-18，需要繼續(xù)探討這三種分子是否對(duì)其它細(xì)胞因子的分泌造成影響。采取1×107新孢子蟲速殖子對(duì)小鼠進(jìn)行持續(xù)15d 的腹腔感染，再利用ELISA 方法檢測(cè)血清中的IL-1β，IL-18，IFN-γ 和TNF-α，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新孢子蟲的感染無法介導(dǎo)NLIP3-/-，ASC-/-，Caspase-1/11-/-小鼠及WT 小鼠分泌IL-1β（圖2A）；新孢子蟲感染可以介導(dǎo)WT 小鼠分泌較高的IL-18，但其它三種基因缺失小鼠分泌的IL-18 數(shù)量顯著降低（圖2B）。并且三種基因缺失小鼠分泌IFN-γ 的數(shù)量也較WT 小鼠明顯降低（圖2C）。四種小鼠所分泌的TNF-α 數(shù)量無顯著差異（圖2D）。

4 討論

NLRP3 炎癥小體需要雙重信號(hào)的激活，第一種信號(hào)是由NF-KB 信號(hào)通路激活的，激活后，pro-IL-1β 和 pro-IL-18表達(dá)上調(diào)；第二種信號(hào)是由各種 DAMPs 或 PAMPs 激活的，與此同時(shí)，可以介導(dǎo) IL-1β/IL-18 成熟分泌和細(xì)胞焦亡。為了進(jìn)一步探討小鼠感染新孢子蟲后，NLRP3 炎癥小體在機(jī)體中的作用，本研究利用NLRP3，ASC 及caspase-1/11 缺失小鼠開展了一系列的試驗(yàn)。

圖3.2 NLRP3，ASC 和 caspase-1/11在誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子中的作用

NLRP3，ASC 及caspase-1/11 在對(duì)宿主的保護(hù)過程及抵抗新孢子蟲的傳播中發(fā)揮著各自的作用。其中，NLRP3和ASC 主要的作用是控制宿主對(duì)新孢子蟲的易感性，而caspase-11 則會(huì)影響caspase-1 對(duì)新孢子蟲感染的易感性。缺失NLRP3，Asc 和 caspase-1/11 的小鼠感染新孢子蟲后，IL-1β 的成熟分泌及caspase-1 活化明顯減少甚至消失，說明新孢子蟲激活的炎癥小體反應(yīng)依賴NLRP3，Asc 和 caspase-1/11。

機(jī)體感染新孢子蟲之后，可以激發(fā)機(jī)體的Th1 免疫應(yīng)答，可以介導(dǎo)IFN-γ 和IL-12 的大量分泌，而且這些細(xì)胞因子在清除新孢子蟲和抗新孢子蟲的過程中發(fā)揮非常重要的作用。將IFN-γ 缺失的小鼠感染新孢子蟲后，小鼠不能使T 細(xì)胞分化，且NO 分泌減少，同時(shí)小鼠的存活率顯著下降。在本研究中，NLRP3，Asc 和 caspase-1/11 缺失小鼠感染新孢子蟲后，測(cè)量血清中的IFN-γ，結(jié)果顯示，IFN-γ 分泌明顯減少，推測(cè)這或許和炎癥小體介導(dǎo)分泌的IL-18 有關(guān)。

5 結(jié)論

通過以上的數(shù)據(jù)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，由新孢子蟲感染所分泌的IL-18 部分依賴NLRP3，主要依賴ASC 和Caspase-1/11；在清除新孢子蟲與保護(hù)宿主時(shí)，這三種分子發(fā)揮不同的作用；NLRP3，ASC，Caspase-1/11 在新孢子蟲早期感染中介導(dǎo)IFN-γ 的分泌，對(duì)宿主抗新孢子蟲的Th1 應(yīng)答有促進(jìn)作用。