代文強,李瑤玲,劉凱,李林晴,趙悅平,趙書崗

(1河北農(nóng)業(yè)大學 現(xiàn)代科技學院，河北 保定 071001；2河北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院, 河北 保定 071001； 3河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001； 4河北農(nóng)業(yè)大學 園藝學院, 河北 保定 071001)

核桃(JuglansregiaL.)是世界著名的“四大堅果”之一，具有悠久的栽培歷史，豐富的營養(yǎng)和良好的保健作用，是我國重要經(jīng)濟樹種[1-2]。低溫是影響植物生長發(fā)育的重要因素之一，全球每年因低溫傷害造成的農(nóng)林作物的經(jīng)濟損失高達數(shù)10億[3-4]。核桃已在我國北方及西南地區(qū)廣泛種植，但近年來頻發(fā)的凍害和冷害，嚴重影響核桃的產(chǎn)量和品質(zhì)。

1987年在玉米(ZeamaysL.)中發(fā)現(xiàn)首個與玉米糊粉層花青素形成有關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子COLORED1(C1)，研究人員開始逐漸挖掘這類轉(zhuǎn)錄因子在植物中的各種作用[5]。在植物中，MYB類轉(zhuǎn)錄因子主要分為3個亞類：R1MYB、R2R3-MYB和R1R2R3-MYB，其中R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子是數(shù)量最多的MYB轉(zhuǎn)錄因子[6]，目前在不同物種中共發(fā)現(xiàn)100～250個MYB家族基因[7-8]，其中擬南芥[Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.)]中至少有126個，除此之外葡萄(VitisviniferaL.)、玉米(Zeamays)、水稻(OryzasativaL.)、大豆[Glycinemax(L.)Merr.]中該類轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量分別為117個、157個、102個和224個[9]。MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子是一個龐大的家族，參與復雜的調(diào)控系統(tǒng)，并在植物逆境功能中有著重要的功能[10]。已有研究表明，R2R3-MYB亞家族許多成員響應生物及非生物脅迫，如擬南芥AtMYB44通過調(diào)節(jié)氣孔運動參與對干旱的應答過程[11-13]，番茄(LycopersiconesculentumMiller)SlCMYB1在水稻中異源表達后使水稻在苗期抗冷性顯著提高[14]，甘蔗(SaccharumofficinarumL.)ScMYBAS1過表達后能提高植株耐鹽脅迫能力[15]。MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御低溫脅迫的過程中發(fā)揮了重要的作用，研究人員將OsMYB4在擬南芥內(nèi)過表達，發(fā)現(xiàn)其可通過提高細胞的抗氧化的能力來提高抗寒性[16-18]。張宇等人對白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)BpMYB4基因在低溫脅迫應答反應的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達BpMYB4基因能使SOD、POD、CAT等物質(zhì)的活性增強，減少植物因脅迫受到的氧化傷害，進而提高白樺抵御低溫的能力[19]。

目前核桃的研究多集中在栽培技術(shù)和產(chǎn)量及品質(zhì)形成等方面，對核桃響應逆境脅迫的調(diào)控機制鮮有報道。本研究以“遼寧8號”和“清香”為試材[20]，采用生物信息學方法，對JrMYB44基因及其編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)特點、保守結(jié)構(gòu)域以及跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白互作預測等進行研究，分析其在低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達情況，旨在為進一步解析MYB響應脅迫反應的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自河北農(nóng)業(yè)大學標本園栽植的“清香”和“遼寧8號”盆栽苗，樹齡2 a，樹高0.5 m，長勢好，無病蟲害。將整株核桃幼苗放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，進行活體0.5 ℃低溫脅迫處理，并設置對照。48 h后對“清香”、“遼寧8號”及對照組葉片進行采集，立即放入液氮，于超低溫冰箱(零下80 ℃)保存?zhèn)溆?。對“清香”的幼莖(4月15日)、幼葉(4月15日)、雌花、雄花、根、老葉(7月15日)、芽進行采集，立即放入液氮，于超低溫冰箱(零下80 ℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1JrMYB44生物信息學分析 以擬南芥AtMYB44為參考基因，通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對獲得核桃JrMYB44(GeneID:109009120)基因序列。利用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)工具查找最長開放閱讀框，并翻譯得到氨基酸序列后；利用在線分析網(wǎng)站ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)分析核桃JrMYB44蛋白理化性質(zhì)；利用TMHMM Serverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測其跨膜結(jié)構(gòu)；利用PSIPRED V4.0 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)、SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)進行預測分析；利用在線工具SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白信號肽結(jié)構(gòu)；利用NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測蛋白磷酸化位點；利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)工具對保守基序進行分析；利用Plant-mPLoc、Plant CARE和DNAMAN進行亞細胞定位預測、啟動子分析和多序列比對；利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(neighbor-joining，bootstrap值設為1 000)，用于系統(tǒng)進化分析的擬南芥和其他物種的蛋白序列來自NCBI和TAIR數(shù)據(jù)庫。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄表達分析 將超低溫冰箱中保存的經(jīng)低溫脅迫處理48 h的“清香”和“遼寧8號”葉片樣本及保存的“清香”不同組織樣本(雌花、果、老葉、幼莖、幼葉、雄花、芽)送至北京諾禾致源有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測定，重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃JrMYB44 DNA 序列及編碼氨基酸序列分析

根據(jù)所得核桃JrMYB44基因序列進行分析，結(jié)果顯示JrMYB44基因全長為1 362 bp，開放閱讀框的長度為966 bp，共編碼321個氨基酸(圖1)。

2.2 核桃JrMYB44基因編碼氨基酸的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域及結(jié)構(gòu)分析

利用在線分析工具ProtParam tool對核桃Jr-MYB44編碼氨基酸進行分析預測，結(jié)果顯示其分子量為34.798 kD，理論等電點為7.600，帶負電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為35，帶正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為36，分子式為C1494H2409N445O480S16，原子總數(shù)為4 844，不穩(wěn)定系數(shù)為57.470，脂肪族氨基酸指數(shù)為72.310，平均總親水性為-0.505，屬于不穩(wěn)定親水蛋白。預測其包含19種氨基酸，丙氨酸(Ala)含量最高，苯丙氨酸(Phe)含量最少。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)其存在MYB家族的功能域(圖2-a)。JrMYB44蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析顯示存在許多螺旋、β-折疊、延伸鏈和卷曲結(jié)構(gòu)，其中α螺旋占33.64%，不規(guī)則卷曲等其余結(jié)構(gòu)共占66.36%(圖2-b)。分析JrMYB44蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示存在螺旋結(jié)構(gòu)(圖2-c)。

注:*是終止密碼子。

注： (a)是JrMYB44保守結(jié)構(gòu)域預測； (b)是JrMYB44二級結(jié)構(gòu)預測； (c)是JrMYB44三級結(jié)構(gòu)預測。

2.3 核桃JrMYB44蛋白磷酸化位點和跨膜結(jié)構(gòu)分析預測

JrMYB44蛋白磷酸化位點分析結(jié)果顯示其氨基酸序列有可能發(fā)生磷酸化的氨基酸位點共有46個，酪氨酸磷酸位點3個，蘇氨酸磷酸化位點12個，絲氨酸磷酸化位點31個(圖3-a)，推測其主要是通過絲氨酸磷酸化影響相關(guān)功能。采用TMHMM Serverv.2.0進行分析預測結(jié)果顯示JrMYB44不存在跨膜蛋白結(jié)構(gòu)(圖3-b)。

注：(a)中橫坐標為所提交蛋白序列對應氨基酸殘基序號，縱坐標為發(fā)生磷酸化可能性；(b)中橫坐標為所提交蛋白序列對應氨基酸殘基序號，縱坐標為橫軸上每個氨基酸位于膜內(nèi)測(inside)、膜外側(cè)(outside)和跨膜螺旋區(qū)概率值。

2.4 核桃JrMYB44蛋白的信號肽、亞細胞定位、蛋白互作預測與啟動子分析

JrMYB44蛋白中不存在信號肽，蛋白定位于細胞核中。采用Plant CARE在線網(wǎng)址分析JrMYB44基因的啟動子區(qū)的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)存在光響應調(diào)節(jié)元件ACE、G-Box、厭氧誘導調(diào)節(jié)元件ARE、啟動子和增強子元件CAAT-Box和多個啟動子增強元件(圖4)。通過比對獲得核桃MYB44蛋白與擬南芥MYBR1(又名MYB44)蛋白為高度同源蛋白(圖5)，以其為參考進行蛋白互作預測，結(jié)果表明在互作蛋白中，部分參與響應低溫脅迫途徑[21-23]。

注：方框里為順式作用元件的序列及名稱。

圖5 JrMYB44蛋白互作預測

2.5 不同植物間的JrMYB44的同源性比對及進化分析

利用DNAMAN對JrMYB44及與其同源性較高的序列進行多序列比對，結(jié)果顯示，核桃JrMYB44蛋白與其他植物一樣有R2R3-MYB功能域(圖6)。

將JrMYB44序列提交到NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行比對，JrMYB44與胡楊PeMYB44-like(PopuluseuphraticaOliv.，XP_011006987.1)、毛果楊PtMYB44(Populustrichocarpasubsp.hastata，XP_024451715.1)、棗ZjMYB44(ZiziphusjujubaMill.，XP_015865918.1)、葡萄 VrMYB44(VitisviniferaL.，XP_034691187.1)、野大豆GsMYB44-like(Glycinemax(L.) Merr.，XP_028210829.1)、甜櫻桃PaMYB44-like(Prunusavium，XP_021829741.1)、橡膠樹HbMYB44(Heveabrasiliensis, XP_021654680.1)、桃PpMYB44(Prunuspersica，XP_020421556.1)、阿月渾子PvMYB44-like(Pistaciavera，XP_031253628.1)、歐洲栓皮櫟QsMYB 44-like(Quercussuber，XP_023910544.1)、南瓜CmMYB44-like(Cucurbitamoschata，XP_022950120.1)、陸地棉GhMYB44-like(GossypiumhirsutumL.，XP_016731006.1)、樹棉GaMYB44-like(GossypiumarboretumL., XP_017603005.1)、蘋果MdMYB44-like(MalusMill.，XP_028963833.1)、白梨PbMYB44(Pyrus

bretschneideri，XP_009367 649.1)進行同源性分析，相似性分別為62.88%、65.07%、61.38%、63.88%、60.24%、61.88%、62.39%、59.94%、62.01%、57.85%、63.73%、55.59%、56.93%、61.56%、62.73%，與毛果楊PtMYB44的同源性最高。采用MEME分析核桃JrMYB44和與其親緣性較高的MYB蛋白序列，預測了10個motif且標注了其在相應序列的位置(圖7)。系統(tǒng)進化分析與核桃JrMYB44同源性較高蛋白，結(jié)果顯示，JrMYB44與毛果楊PtMYB44親緣關(guān)系最近。

圖6 JrMYB44與其他植物MYB44蛋白序列多重對比，方框標記星號氨基酸是HER基序

注:(a)是JrMYB44與其他物種進化關(guān)系; (b)是保守基序

2.6 JrMYB44在不同組織與低溫脅迫下的表達分析

利用核桃轉(zhuǎn)錄組中的數(shù)據(jù)分析低溫脅迫48 h下在“清香”和“遼寧8號”品種的JrMYB44轉(zhuǎn)錄表達規(guī)律。結(jié)果顯示在對“清香”和“遼寧8號”核桃盆栽苗0 ℃低溫脅迫處理0 h、48 h后，JrMYB44轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，“遼寧8號”是對照組的4.00倍，“清香”是對照組的3.03倍(圖8)。結(jié)合“清香”不同組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，JrMYB44在“清香”芽中表達量最多，在“清香”老葉中轉(zhuǎn)錄表達量最少(圖9)。

注：QX是清香；L8是遼寧8號。

注：CH是雌花；G是根；LY是老葉；NJ是幼莖；NY是幼葉；XH是雄花；Y是芽。

3 討論與結(jié)論

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是一類含有高度保守的DNA結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，其在草本植物(番茄、馬鈴薯、水稻等)、木本植物(楊樹、蘋果、核桃等)中廣泛存在[24]。MYB家族轉(zhuǎn)錄因子與植物的逆境響應有著很密切的關(guān)系，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、抵御不利生長條件等方面上有著重要的作用[25]。李思蕓等對鐵皮石斛的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子全基因組進行了鑒定及生物信息學分析，對不同的R2R3-MYB進行歸類，其中鐵皮石斛DoMYB44歸為S22亞類，該亞類參與非生物脅迫調(diào)控反應以及生長發(fā)育調(diào)控[26]；李穎等對番茄SlMYB44基因進行研究，結(jié)果顯示SlMYB44基因?qū)Ψ牙浜τ许憫?，可能影響番茄御冷機制[27]。李敏等人將擬南芥AtMYB44基因成功轉(zhuǎn)入水稻中后，誘導其過表達，結(jié)果得出，在干旱、低溫、或同一濃度的NaCl和ABA處理1.5～3 h的條件下AtMYB44的表達量明顯提高，且達到最大值，這與本研究中，對“遼寧8號”和“清香”的葉片進行0 ℃低溫脅迫處理48 h后的結(jié)果相一致[21]。已有研究報道，在刺葡萄、楊樹等植物中，MYB轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控植物類黃酮的合成，進而介導逆境響應機制[28-29]。

本研究利用生物信息學方法對JrMYB44基因結(jié)構(gòu)及進化關(guān)系等進行分析預測，結(jié)果顯示，JrMYB44含有R2R3-MYB結(jié)構(gòu)域，JrMYB44與毛果楊PtMYB44親緣關(guān)系最近。通過對JrMYB44基因的啟動子順式作用元件分析，推測JrMYB44可能是具有多種環(huán)境響應能力的轉(zhuǎn)錄因子。蛋白互作分析顯示部分互作蛋白參與響應低溫脅迫途徑，由于JrMYB44含有保守的R2R3-MYB結(jié)構(gòu)域，并根據(jù)前人對相關(guān)基因的研究，結(jié)合低溫脅迫后基因表達量的結(jié)果，可以推斷得出，JrMYB44基因與核桃的抗低溫脅迫存在著一定的關(guān)系，推測JrMYB44可能通過影響類黃酮的合成從而參與調(diào)控核桃的耐低溫脅迫機制。此外，本研究通過JrMYB44在不同組織表達水平分析，JrMYB44在莖、葉、芽等幼嫩器官中高表達，預期同源的擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子AtMYB44屬S22亞類，該亞類參與生長發(fā)育調(diào)控相一致，說明核桃JrMYB44可能在幼嫩器官的生長發(fā)育過程中參與調(diào)控[30]。

JrMYB44基因長1 362 bp，最大開放閱讀框966 bp，與毛果楊PtMYB44進化關(guān)系較近，轉(zhuǎn)錄水平上能夠響應低溫脅迫誘導升高；并且在“清香”芽、幼葉和雌花中轉(zhuǎn)錄表達水平較高。本研究為進一步探究核桃JrMYB44的相關(guān)功能提供了理論基礎(chǔ)。