李昕蔓，楊開宇，柳俊明，王立成，李清泉，張軍

(1 河北農(nóng)業(yè)大學 林學院，河北 保定 071000；2 保定市滿城區(qū)苗圃場，河北 滿城 072150)

蘋果是薔薇科蘋果屬落葉喬木，具有極高的營養(yǎng)價值、經(jīng)濟價值和觀賞價值，中國蘋果的產(chǎn)量和栽種面積均居世界第一。我國是世界蘋果的起源中心，有21個蘋果屬植物的野生種起源于我國，栽培歷史悠久[1-2]。而新疆野蘋果[Malussieversii(Ledeb.) Roem]是與栽培蘋果品種親緣關系最近的野生種[3]。Richards 等的研究證明，新疆野蘋果是一種第三世紀的殘遺植物，是栽培蘋果品種的祖先種[4]。主要分布在天山山脈西部的托里縣、鞏留縣、霍城縣、新源縣、額敏縣等地區(qū)[5]。新疆野蘋果種質(zhì)資源極其豐富，被認為是經(jīng)濟林樹種中唯一的天然基因庫，也是世界野蘋果基因庫的重要組成部分[6-7]。新疆野蘋果適應性和抗性很強，具有抗寒、抗旱、抗病、耐蟲、耐瘠薄等優(yōu)良特性，并且變異豐富。由于農(nóng)田的極度開發(fā)、過度放牧、病蟲害、亂砍濫伐等種種原因，新疆野蘋果的面積正在逐漸減少，成為了國家瀕危二級保護植物。也正是由于該物種稀少以及豐富的遺傳多樣性，新疆野蘋果成為了很多研究者關注的焦點，但是基于形態(tài)指標和生理指標對新疆野蘋果無性系進行綜合評價方面的研究還相對較少。

基因與環(huán)境的相互作用產(chǎn)生了植物的表型，而表型多樣性也是植物對環(huán)境的適應性表現(xiàn)[8-13]。植株的表型性狀易于觀測和調(diào)查，能簡便、直觀、快速地了解植物群體的遺傳多樣性[14-17]。同時，植物的表型性狀與育種目標和生產(chǎn)實際聯(lián)系緊密，對種質(zhì)資源群體表型多樣性的分析是育種過程中的基礎性工作和重要內(nèi)容[18-23]。

以18個新疆野蘋果無性系為試驗材料，對其形態(tài)指標和生理指標進行方差分析、相關性分析、聚類分析以及主成分分析，對其進行全面的種質(zhì)資源評價，為新疆野蘋果種質(zhì)資源的開發(fā)利用及良種選育提供一定支撐。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

試驗地位于河北省保定市滿城縣南韓村鎮(zhèn)孫村保定市滿城區(qū)苗圃場，地理坐標為北緯38°51′，東經(jīng)115°17′。該地氣候?qū)贉貛Т箨懶约撅L氣候，春季干旱多風、夏季炎熱多雨、秋季天高氣爽、冬季寒冷少雪、四季分明、光照充足、雨熱同期。年平均氣溫12.3 ℃，極端最低溫度-23.4 ℃，> 10 ℃的積溫為4 340.4 ℃，日照時數(shù)2 412.7 h，無霜期196 d，全年平均降水量560 mm，年最大降水量911.7 mm，降水主要集中在7、8月份。土壤類型為沙壤土，質(zhì)地比較疏松，無明顯分層。土壤保水能力較弱，通透性較好，晝夜溫差變化較大。

1.2 試驗材料

試驗所用的18個新疆野蘋果無性系是2010年從新疆天山地區(qū)采集的600株新疆野蘋果野生單株中篩選出來的，于第2年3月份采用枝接法嫁接在距離地面10 cm高的2 a生的海棠(Malusspectabilis)砧木上，每個無性系嫁接10株，苗木生長期間正常水肥管理。

2018年7月，每個無性系隨機選擇3株生長良好的單株，測定其樹高、地徑、東西冠幅、南北冠幅、枝下高、病蟲害率、分枝角度、單葉面積、比葉重、長寬比等形態(tài)指標。

2018年7月，從每個無性系隨機選取的3株樹上采集10片生長良好、無病蟲害、成熟、無破損的功能葉，測定其葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量、類胡蘿卜素含量、花青素含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、色度參數(shù)等生理指標。

1.3 研究方法

1.3.1 新疆野蘋果無性系形態(tài)指標測定 用鋼卷尺測量18個新疆野蘋果無性系的樹高、東西冠幅、南北冠幅、枝下高等；用胸徑尺測量18個新疆野蘋果無性系的地徑；用量角器測量18個新疆野蘋果無性系的分枝角度；每個無性系隨機調(diào)查100片成熟的葉片，統(tǒng)計有病害和蟲害葉片的數(shù)量，計算病蟲害率；每個無性系隨機選取5片生長良好、無病蟲害、成熟、無破損的功能葉，帶回實驗室，進行葉片掃描，然后用葉形分析軟件Lamina對各葉形指標進行分析，得到各無性系的單葉面積和長寬比；用電熱鼓風干燥箱在80 ℃條件下將葉片烘干至恒重，稱其干重，再根據(jù)葉面積計算比葉重。以上各形態(tài)指標的測定均設3次重復。

1.3.2 新疆野蘋果無性系葉片生理指標測定 18個新疆野蘋果無性系葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量、類胡蘿卜素的測定參照鄒琦、李合生等的方法[24-25]。用電子天平稱取0.1 g無病蟲害、無破損、成熟的葉片，將葉片剪碎后放到10 mL的離心管中，加入10 mL 95 %的乙醇溶液，將離心管蓋緊，防止揮發(fā)。室溫避光放置24 h，保證葉片完全變白，用紫外可見分光光度計測定提取液在3個不同波長(470 nm、645 nm、663 nm)的吸光度值。

花青素測定是在宋巖方法的基礎上略做改動[26]。稱取0.1 g無病蟲害、無破損、成熟的葉片，將葉片剪碎后放到10 mL的離心管中，加入10 mL 10%的稀鹽酸，將離心管蓋緊，室溫避光放置2 h，保證葉片完全變白，用紫外可見分光光度計測定提取液在535 nm的吸光度值。

可溶性糖采用蒽酮法進行測定，試驗過程及步驟參照孔祥生等的測定方法[27]?？扇苄缘鞍撞捎每捡R斯亮藍G-250染色法進行測定，試驗過程及步驟參考樊金娟等的測定方法[28]。葉片色度測定參照Wang的方法[29]，用色度計對葉片色度參數(shù)(L*、a*、b*)進行測定，其中，L*表示色澤明亮度(黑白)，a*表示紅綠色度，b*表示黃藍色度[57]。以上各生理指標的測定均設3次重復。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用軟件Excel和SPSS 11.5對18個新疆野蘋果無性系的形態(tài)指標、生理指標等進行方差分析、顯著性分析以及主成分分析。

用軟件R對18個新疆野蘋果無性系的形態(tài)指標、生理指標等進行相關性分析。

用軟件DPS 7.05繪制18個新疆野蘋果無性系的聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 無性系形態(tài)和生理指標對比分析

18個新疆野蘋果無性系形態(tài)指標方差分析見表1。

表1 18個新疆野蘋果無性系形態(tài)指標

由表1可知，18個新疆野蘋果無性系10個形態(tài)指標變異系數(shù)的變化范圍為2.19%～15.91%，南北冠幅的變異系數(shù)(15.91%)最大，葉面積的變異系數(shù)(2.19%)最小。各形態(tài)指標變異系數(shù)從大到小依次為南北冠幅>病害情況>比葉重>東西冠幅>分枝角度>枝下高>樹高>長寬比>地徑>葉面積。

18個新疆野蘋果無性系的樹高在2.77～4.27 m之間，平均樹高為3.48 m；地徑在6.67～11.40 cm之間，平均地徑為8.83 cm；東西冠幅在153.33～326.67 cm之間，平均東西冠幅為224.22 cm；南北冠幅在138.33～261.67 cm之間，平均南北冠幅為196.39 cm；枝下高在40.33～67.67 cm之間，平均枝下高為51.31 cm；病蟲害率在4.33%～48.33%之間，平均病蟲害率為28.50%；分枝角度在34.73°～83.00°之間，平均分枝角度為60.27°；單葉面積在140 7.05～469 1.14 cm2之間，平均葉面積為237 6.19 cm2；比葉重在0.004 8～0.010 6 cm2/g之間，平均比葉重為0.007 8 cm2/g；葉片長寬比在1.36～2.01 cm之間，平均葉片長寬比為1.78 cm。

18個新疆野蘋果無性系生理指標方差分析見表2。

表2 18個新疆野蘋果無性系葉片色素指標

表3 18個新疆野蘋果無性系葉片色度及營養(yǎng)指標

由表2、表3可知，18個新疆野蘋果無性系10個葉片生理指標變異系數(shù)的變化范圍為2.04%～13.58%，葉綠素b的變異系數(shù)(13.58%)最大，葉面積的變異系數(shù)(2.04%)最小。各生理指標變異系數(shù)從大到小依次為葉綠素b>a*>b*>花青素>葉綠素總量>葉綠素a >類胡蘿卜素>可溶性蛋白>可溶性糖>L*。

18個新疆野蘋果無性系的葉綠素a含量在1.89～2.26 mg/g之間，平均葉綠素a含量為2.05 mg/g；葉綠素b含量在0.53～1.68 mg/g之間，平均葉綠素b含量為1.03 mg/g；葉綠素總量在2.70～4.05 mg/g之間，平均葉綠素總量為3.18 mg/g；類胡蘿卜素含量在0.16～0.63 mg/g之間，平均類胡蘿卜素含量為0.52 mg/g；花青素含量在0.54～3.76 mg/g之間，平均花青素含量為2.10 mg/g；可溶性糖含量在54.26～139.93 mg/g之間，平均可溶性糖含量為99.09 mg/g；可溶性蛋白含量在9.34～20.20 mg/g之間，平均可溶性蛋白含量為13.93 mg/g；L*值在44.54～48.32之間，平均L*值為46.45；a*值在-4.38～-2.42之間，平均a*值為-3.23；b*值在4.67～8.60之間，平均b*值為6.54。

2.2 無性系形態(tài)和生理指標相關性分析

18個新疆野蘋果無性系形態(tài)指標和生理指標相關性分析見圖1。

圖1 18個新疆野蘋果無性系各形態(tài)指標與生理指標相關性分析

對18個新疆野蘋果無性系的10個形態(tài)指標和10個生理指標進行相關性分析，由圖1可知，與樹高呈極顯著正相關關系的指標有地徑、葉綠素b、葉綠素總量，相關系數(shù)分別為0.942、0.871、0.872；與地徑呈極顯著正相關關系的指標有樹高、葉綠素b、葉綠素總量，相關系數(shù)分別為0.942、0.826、0.841；病蟲害率和L*之間呈極顯著正相關關系，相關系數(shù)為0.637；枝下高和b*之間存在極顯著正相關關系，相關系數(shù)為0.649。

2.3 無性系形態(tài)和生理指標聚類分析

18個新疆野蘋果無性系形態(tài)指標和生理指標聚類分析見圖2。

由圖2可知，18個新疆野蘋果無性系可以被100%區(qū)分開，遺傳距離的變化范圍為3.230～9.075，平均遺傳距離為5.089。在遺傳距離6.016處，18個新疆野蘋果無性系被分為5類。第1類為M1、M4等2個無性系；第2類為M5、M9、M13、M10、M18、M6、M11、M8、M15等 9個無性系；第3類為M7、M14、M17、M1等4個無性系；第4類為M2、M3等2個無性系；第5類僅有M12 1個無性系。

圖2 18個新疆野蘋果無性系各形態(tài)指標與生理指標聚類分析

2.4 無性系形態(tài)和生理指標主成分分析

18個新疆野蘋果無性系形態(tài)指標和生理指標主成分分析見表4和表5。

表4 各主成分的特征值及貢獻率

表5 各形態(tài)指標與生理指標主成分分析

表5(續(xù))

對18個新疆野蘋果無性系的10個形態(tài)指標和10個生理指標進行主成分分析(表4)，選取特征值大于1的主成分，得到5個主成分，各主成分的貢獻率分別為32.910%(F1)、22.046%(F2)、13.571%(F3)、10.498%(F4)和5.165%(F5)，5個主成分的累計貢獻率達到84.191%。根據(jù)主成分分析結(jié)果，計算18個新疆野蘋果無性系的綜合得分(表5)，其中M12得分最高，為0.975；M16得分最低，為-0.865。

18個新疆野蘋果無性系基本特性描述見表6。

表6 18個新疆野蘋果無性系基本特性

由表6可知，M4樹形優(yōu)美，生長旺盛，是觀枝、觀葉的優(yōu)良品種，是園林綠化中不可多得的樹種；M11、M12果實品質(zhì)較好，是優(yōu)良的觀果品種。

3 討論與結(jié)論

18個新疆野蘋果無性系10個形態(tài)指標變異系數(shù)的變化范圍為2.19%～15.91%，南北冠幅的變異系數(shù)最大(15.91%)；18個新疆野蘋果無性系10個生理指標變異系數(shù)的變化范圍為2.04%～13.58%，葉綠素b的變異系數(shù)最大(13.58%)。18個新疆野蘋果無性系各性狀指標變異幅度較大，說明新疆野蘋果遺傳多樣性較為廣泛，選擇育種潛力較大。

樹高、地徑、冠幅能夠直觀地反映出樹木的生長勢，是篩選優(yōu)良品種的重要形態(tài)指標。葉綠素類、類胡蘿卜素類、類黃酮類和甜菜堿色素是存在于植物葉片中的主要色素，它們都屬于植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，正是這些色素的相互作用才使植物的各個器官(葉片、花、果實等)具有了一定的色彩[30]。葉綠素是植物體內(nèi)與光合作用最為密切的一種色素，對植物的生長發(fā)育起著至關重要的作用，同時也是優(yōu)良種質(zhì)資源評價的重要指標[31-32]?？扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍资侵参矬w內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，與植物的生長發(fā)育及抗逆性密切相關。因此，經(jīng)常把這2個指標作為篩選優(yōu)良種質(zhì)資源的重要指標[33-34]。

本研究顯示，各無性系葉綠素總量與樹高、地徑之間的相關系數(shù)分別為0.872、0.841，呈現(xiàn)極顯著的正相關關系，說明葉綠素總量的高低直接決定著新疆野蘋果生長的快慢，該研究結(jié)果與趙洪兵等在小麥葉綠素與農(nóng)藝性狀以及光合特性的研究結(jié)果一致[35]；與張杰等對蒙古櫟葉綠素含量與其樹高、地徑相關性的研究結(jié)果一致[36]；也與孫小霞等在火炬松生理生化指標與生長性狀的相關性研究結(jié)果一致[37]。其主要原因是葉綠素的含量直接影響著植物的光和作用，從而間接地對植物的生長發(fā)育造成影響。

本研究中，花青素的含量與葉片色度參數(shù)a*值呈現(xiàn)極顯著正相關關系，相關系數(shù)為0.820，這與李單等對李屬植物的研究結(jié)果一致，說明葉片色度參數(shù)a*值與葉片中花青素含量密切相關[30]。

基于10個形態(tài)指標和10個生理指標進行聚類分析，18個新疆野蘋果無性系被分為5類，充分說明了新疆野蘋果的遺傳資源較為豐富。

無性系M12樹體高大，生長勢旺盛，得分最高；無性系M16樹體矮小，生長勢較弱，得分最低。