孫月欣，劉凱,，馮啟科，李林晴,，王紅霞

(1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071001; 2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)山區(qū)研究所，河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001)

bHLH(basic/Helix-Loop-Helix，堿性-螺旋-環(huán)-螺)轉(zhuǎn)錄因子是僅次于 MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族的第二大基因家族，通過使特定的氨基酸殘基與靶基因相互作用，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)[1-2]。經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)類黃酮和花青素的生物合成以及種子種皮色素積累中發(fā)揮著重要作用[1-2]。

花青素在植物中分布廣泛，是植物的主要水溶性色素之一，屬類黃酮的1種，是花色苷水解而得到的有顏色的苷元，花青素由類黃酮途徑的特定分支產(chǎn)生，在應(yīng)對各種非生物脅迫方面，許多植物通過積累花青素來提高植株的抗寒能力[3-4]。研究表明，調(diào)控花青素合成途徑的轉(zhuǎn)錄因子主要分屬在3個基因家族中：MYB家族、bHLH家族和WD40家族[5]。由WD家族蛋白TTG1與bHLH轉(zhuǎn)錄因子、MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成1種三元復(fù)合物(簡稱MWB)，許多調(diào)控基因都是通過直接或間接參與構(gòu)成MWB復(fù)合物的方式來調(diào)控花青素合成途徑[6]。在擬南芥中，花青素合成途徑主要依靠MYB、bHLH、WD40-repeat以及bZIP4種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，大部分物種的花青素都是由這4類轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合而成的蛋白復(fù)合體直接調(diào)控激活的，也有少數(shù)花青素合成只需要單個調(diào)控因子就能激活[7-8]。而在擬南芥中，參與調(diào)控花青素合成的bHLH蛋白：TT8 (At bHLH042)、GL3 (At bHLH001)、EGL3(MYC-146/At bHLH002)和MYC1(At bHLH012)均聚集于bHLH家族第3亞組(Subgroup III)。TT8能夠依賴于TTG1 (WD40蛋白)和TT2(R2R3-MYB蛋白)來調(diào)節(jié)DFR和BAN的表達(dá)[9-10]。而在“紅陽”獼猴桃果肉花青素形成過程中的調(diào)控作用研究中發(fā)現(xiàn)，AdGL3基因的表達(dá)水平與獼猴桃花青素的凈積累過程基本一致，即在凈積累過程中表達(dá)水平比較高，而凈積累停止后，該基因的表達(dá)水平也相應(yīng)降低[11]。由此可知，GL3基因在花青素的形成過程中起著重要作用。

核桃(JuglansregiaL.)，又名胡桃，是胡桃科，核桃屬的落葉喬木植物，在我國有悠久的栽培歷史，與扁桃、腰果、榛子并稱為“世界四大堅(jiān)果”，核桃素有“木本油料之王”的稱號，是我國主要的經(jīng)濟(jì)林樹種之一[12-13]。核桃是喜溫樹種，但是非生物脅迫特別是晚霜與倒春寒使核桃造成大面積減產(chǎn)[14-16]。目前為止，關(guān)于核桃在分子水平改善核桃耐低溫脅迫還鮮有報道。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)對JrGL3結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行分析，為研究JrGL3基因調(diào)控核桃中類黃酮和花青素途徑響應(yīng)低溫脅迫奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料是種植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園的“遼寧8號”(耐低溫)和“清香”(不耐低溫)核桃(JuglansregiaL.)盆栽[17]。試驗(yàn)材料分為正常組(冷處理0 h)和0.5 ℃(冷處理48 h)。低溫處理48 h后采集每株第1片復(fù)葉上左數(shù)第2片單葉送至北京諾禾致源科技股份有限公司用于RNA-Seq測序，3次重復(fù)。不同組織(根、4月26日幼莖、4月26日幼葉、雄花、雌花、7月15日成熟葉)均采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園“清香”核桃，采集后液氮速凍，送至北京諾禾致源科技股份有限公司用于RNA-Seq測序，3次重復(fù)。

1.2 核桃JrGL3蛋白生物信息學(xué)分析

本試驗(yàn)中所用到的CDS序列與DNA序列均由NCBI提供下載。

分別利用 ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)工具和 DNAMAN 尋找最長的開放閱讀框和得到氨基酸序列；分別利用在線分析工具ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)、TMPred (https://embnet.vitalit.ch/software/TMPRED_form.html)、PSIPRED V4.0 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)、SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)、SignalP 3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)、TMHMM Serverv.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、NetPhos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和 MEME (http://memesuite.org/tools/meme)分析理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、信號肽、磷酸化位點(diǎn)和聚類分析。分別利用 Plant-mPLoc、Plant CARE 和 DNAMAN 多序列比對工具分析亞細(xì)胞定位、啟動子和多序列比對等參考肖化興的方法[18]。利用 MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Neighbor-joining, bootstrap 值設(shè)為 1 000)。用于系統(tǒng)進(jìn)化分析的擬南芥蛋白序列來自TAIR 數(shù)據(jù)庫。

1.3 表達(dá)分析

對“遼寧8號”(耐低溫)和“清香”(不耐低溫)的葉片進(jìn)行0 ℃低溫脅迫處理，并設(shè)置對照，48 h后進(jìn)行RNA-Seq分析GL3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量。針對“清香”不同組織進(jìn)行RNA-Seq轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃JrGL3 cDNA 的基因信息分析

核桃JrGL3的序列搜索下載于NCBI已公布核桃蛋白序列，其基本信息，見表1。

表1 核桃JrGL3基本信息

由表1可知，JrGL3(GeneID：108979206)基因長4 982 bp，編碼637 aa，有12個外顯子，11個內(nèi)含子，最大開放閱讀框1 914 bp。

通過DNAMAN進(jìn)行拼接組裝，得到JrGL3cDNA基因克隆序列(圖1)，結(jié)果顯示JrGL3cDNA全長為4 982 bp，其1-637為該基因的編碼區(qū)，開放閱讀框的長度為1 914 bp，共編碼637個氨基酸。

注: *是終止密碼子。

2.2 核桃JrGL3基因編碼氨基酸的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域及結(jié)構(gòu)分析

利用ExPasy對基因的等電點(diǎn)(pI)、蛋白大小(kD)等蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，見表2。

表2 核桃JrGL3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

由表2可知，JrGL3分子量為71.15 kD，理論等電點(diǎn)為5.23，分子式為C3111H4968N862O984S30，原子總數(shù)為9 955，不穩(wěn)定系數(shù)為58.43，表明其為不穩(wěn)定蛋白，脂肪族氨基酸指數(shù)為87.21，平均總親水性為-0.365，屬于親水性蛋白。預(yù)測其包含 20 種氨基酸，絲氨酸(Ser)含量最高，色氨酸(Trp)含量最少。

利用PSIPRED V4.0、SWISS-MODEL對核桃JrGL3結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域的分析，見圖2。

由圖2可知，保守結(jié)構(gòu)域分析(圖2-a)發(fā)現(xiàn)其存在bHLH-SF超級家族的功能域，根據(jù) NCBI 所帶的注釋信息可知該家族包括來自擬南芥的幾個bHLH轉(zhuǎn)錄因子，如TT8、EGL1和GL3。JrGL3，也被稱為AtbHLH1或AtMYC6。JrGL3蛋白的二級結(jié)構(gòu)(圖2-b)分析顯示存在許多螺旋、β-折疊、延伸鏈和卷曲結(jié)構(gòu)。分析JrGL3蛋白的三級結(jié)構(gòu)(圖2-c)，結(jié)果顯示存在螺旋、折疊等結(jié)構(gòu)。

注：(a)是JrGL3保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測；(b)是JrGL3二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；(c)是JrGL3三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

2.3 核桃JrGL3磷酸化位點(diǎn)和跨膜結(jié)構(gòu)分析預(yù)測

利用TMHMM Serverv.2.0、NetPhos 3.1對核桃JrGL3磷酸化位點(diǎn)和跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測，見圖3。

圖3 JrGL3蛋白的磷酸化位點(diǎn)(a)和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(b)

由圖3可知，JrGL3磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果顯示其氨基酸序列有可能發(fā)生磷酸化的氨基酸位點(diǎn)共有62個，酪氨酸磷酸位點(diǎn)5個，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)15個，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)42個(圖3-a)，推測其主要是通過絲氨酸磷酸化調(diào)控相關(guān)功能。采用 TMHMM Serverv.2.0 進(jìn)行分析預(yù)測，結(jié)果顯示JrGL3不存在跨膜蛋白結(jié)構(gòu)(圖3-b)。

2.4 核桃JrGL3蛋白的信號肽、亞細(xì)胞定位、啟動子分析和蛋白互作預(yù)測

利用SignalP 3.0 Server在線工具對JrGL3蛋白的信號肽進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其不存在信號肽，預(yù)測其定位于細(xì)胞核中，說明JrGL3蛋白在核桃細(xì)胞的細(xì)胞核上表達(dá)。采用Plant CARE在線網(wǎng)址分析JrGL3基因的啟動子區(qū)的順式作用元件(圖4)，發(fā)現(xiàn)存在光響應(yīng)元件ACE、厭氧誘導(dǎo)調(diào)節(jié)元件ARE、啟動子和增強(qiáng)子元件CAAT-Box、光響應(yīng)調(diào)節(jié)元件G-Box和G-Box、低溫響應(yīng)元件LTR、赤霉素反應(yīng)性元件TATC-Box。以擬南芥蛋白為參考，核桃GL3蛋白與擬南芥GL3蛋白為高度同源蛋白，在互作蛋白中，部分參與花青素的合成途徑[8-11]，例如MYB75產(chǎn)生花青素色素1的轉(zhuǎn)錄激活劑，當(dāng)與BHLH12 / MYC1、EGL3或GL3結(jié)合時，促進(jìn)苯丙素衍生物如花色苷和原花青素的合成，見圖5。

注: 方框里包括順式作用元件的序列及名稱。

圖5 擬南芥JrGL3蛋白互作預(yù)測

2.5 JrGL3的同源性比對及進(jìn)化分析

利用 DNAMAN 對JrGL3及與其同源性較高的序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示，核桃 GL3 蛋白有bHLH-SF 功能域，植物bHLH結(jié)構(gòu)域都具有一個在5、9和13位氨基酸殘基分別是 H-E-R 的特征(圖6)。

將JrGL3序列提交到 NCBI 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，JrGL3與核桃(Juglansregia， XP01880 5371)、歐洲栓皮櫟(Quercussuber，XP023923836)、梅(Prunusmume，XP008238828)、桃樹(Prunuspersica，XP020420271)、歐李(Prunusavium，XP02 1820872)、可可豆(Theobromacacao，XP0070402 49)、海棠(Malusdomestica，XP008392582)、棗(Ziziphusjujuba，XP015871249)、阿月渾子(Pistaciavera，XP031278483)、荔枝(Litchichinensis，APP94124)、月季(Rosachinensis，XP024174273)、 橡膠樹(Heveabrasiliensis，XP021668375)、蘋果(Malusdomestica，XP028960493)、葡萄(Vitisvinifera，XP002270239)、歐洲大葉楊(Populustrichocarpa，XP024445100)、番木瓜(Caricapapaya，XP021905999)、大麻(Cannabissativa，XP03050 1846)、榴蓮(Duriozibethinus，XP022732906)、胡楊(Populuseuphratica，XP011029287)、蓖麻(Ricinuscommunis，XP015571770)、樹棉(Gossypiumarboreum，NP001316962)、陸地棉(Gossypiumhirsutum，XP016724946)、雷蒙德棉(Gossypiumraimondii，XP012476149)、金杜鵑(Rhodamniaargentea，XP030551648)、茶(Camelliasinensis，XP028080 219)等25種植物進(jìn)行同源性分析(圖7-a)，結(jié)果表明，JrGL3與阿月渾子(Pistaciavera，XP0312784 83)和歐洲栓皮櫟(Quercussuber，XP023923836)的親緣關(guān)系最近，與梅(Prunusmume，XP008238828)和橡膠樹(Heveabrasiliensis，XP021668375)等作物的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。采用 MEME 分析核桃JrGL3和與其親緣性較高的bHLH蛋白序列(圖7-b)，預(yù)測了10個motif且標(biāo)注了其在相應(yīng)序列的位置，然而，橡膠樹(Heveabrasiliensis，XP021668375)、葡萄(Vitisvinifera，XP002270239)、歐洲大葉楊(Populustrichocarpa，XP024445100)、胡楊(Populuseuphratica，XP011029287)、茶(Camelliasinensis，XP028080219)預(yù)測到9個motif。

注：方框記星號氨基酸是HER基序。

注:(a)核桃JrGL3氨基酸序列與其他物種氨基酸序列的同源樹;(b)JrGL3與其他植物bHLH蛋白序列 MEME 聚類分析。

2.6 JrGL3在核桃不同品種和組織中的表達(dá)規(guī)律分析

利用核桃轉(zhuǎn)錄組中的數(shù)據(jù)分析核桃JrGL3基因在“遼寧8號”(耐低溫)和“清香”(不耐低溫)品種低溫脅迫48 h后的表達(dá)規(guī)律，見圖8。由圖8可知，JrGL3在“遼寧8號”葉片呈現(xiàn)顯著上升，比對照上升2.7倍；JrGL3在“清香”葉片呈現(xiàn)顯著上升，比對照上升2.1倍。由此表明JrGL3基因在不同品種中均有表達(dá)，而在“清香”中表達(dá)量較高。

圖8 JrGL3基因在不同品種中的表達(dá)分析

低溫脅迫“清香”(不耐低溫)48 h后，不同組織中JrGL3基因的表達(dá)分析，見圖9。由圖9可知，在“清香”品種不同組織轉(zhuǎn)錄組分析，JrGL3基因在“清香”雌花、根、成熟葉、幼莖、幼葉、雄花、芽中均有表達(dá)，其中JrGL3在雌花中表達(dá)量最高，而在雄花與老葉中表達(dá)量較低，說明JrGL3基因在不同組織中的表達(dá)量存在一定差異，但無組織特異性。

注：QXCH是清香雌花；QXG是清香根；QXLY是清香成熟葉；QXNJ是清香幼莖；QXNY是清香幼葉；QXXH是清香雄花；QXY是清香芽。

3 討論與結(jié)論

bHLH(basic/Helix-Loop-Helix)轉(zhuǎn)錄因子是真核生物界中普遍存在的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[19]。擬南芥中有164個bHLH轉(zhuǎn)錄因子、水稻中有180個bHLH轉(zhuǎn)錄因子、棗樹中有92個bHLH轉(zhuǎn)錄因子、煙草及白菜中分別有190個、230個bHLH轉(zhuǎn)錄因子，bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員廣泛參與調(diào)控植物的生長發(fā)育、植物代謝過程和抗逆過程[20-23]。楊娜等利用生物信息學(xué)對獨(dú)行菜(Lepidiumapetalum) bHLH轉(zhuǎn)錄因子ICE1、bHLH27、bHLH7的結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行了分析預(yù)測，為進(jìn)一步的bHLH轉(zhuǎn)錄因子在獨(dú)行菜種子低溫萌發(fā)過程中的研究奠定基礎(chǔ)[24]。王艷敏克隆了小黑楊PsnICE1基因及其啟動子序列并對其分析，為深入研究小黑楊PsnICE1轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答低溫脅迫調(diào)控的分子機(jī)理提供了理論依據(jù)[25]。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)對基因進(jìn)行組裝拼接，并對其進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析預(yù)測，JrGL3含有bHLH結(jié)構(gòu)域，屬于定位于細(xì)胞核、無信號肽、無跨膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定親水的bHLH家族蛋白；同源進(jìn)化分析表明，核桃與阿月渾子和歐洲栓皮櫟聚為一個分支，阿月渾子進(jìn)化距離較小，而與梅和橡膠樹分支較多，進(jìn)化距離較大，所以JrGL3與阿月渾子(Pistaciavera，XP0312 78483)和歐洲栓皮櫟(Quercussuber，XP02392383 6)的蛋白親緣關(guān)系較近，與梅(Prunusmume，XP00 8238828)和橡膠樹(Heveabrasiliensis，XP021668 375)等植物的蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過JrGL3與其他植物bHLH蛋白序列多重對比，結(jié)果表明每個植物都含有其保守結(jié)構(gòu)域，說明JrGL3蛋白保守。

JrGL3啟動子區(qū)域存在多種順式作用元件，如參與赤霉素等激素響應(yīng)的順式作用元件TATC-Box等；參與光、低溫等非生物脅迫響應(yīng)的ACE、G-Box和G-Box、LTR等；此外JrGL3的啟動子區(qū)域存在一定數(shù)量的與厭氧響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件ARE等。以上結(jié)果表明JrGL3可能是一個具有多種環(huán)境響應(yīng)能力的轉(zhuǎn)錄因子?；ㄇ嗨睾铣芍械腉L3蛋白有典型的HLH結(jié)構(gòu)域，其主要通過促進(jìn)蛋白質(zhì)相互結(jié)合形成的同型二聚體或異型二聚體復(fù)合體來調(diào)控植物相關(guān)功能通路[22,26]。對GL3的結(jié)構(gòu)域功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)包含bHLH區(qū)域在內(nèi)的GL3，其C端主要與bHLH之間形成二聚體有關(guān)，由此來介導(dǎo)GL3的花色苷代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表皮毛發(fā)生調(diào)控。在擬南芥中，由 AtGLl、AtGL3和 AtTTG1形成MBW復(fù)合物通過正向調(diào)控激活A(yù)tGL2基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)表皮毛的發(fā)生，而GL3與擬南芥內(nèi)源的AtGL3競爭結(jié)合AtGL1，破壞了內(nèi)源AtGL1-AtGL3-AtTTG1復(fù)合物對AtGL2的調(diào)控，進(jìn)而抑制了表皮毛的發(fā)生，促進(jìn)了花色苷的合成[27]。TOE1/TOE2與GIS/GIS2/ZFP8蛋白互作，作用于GL3上游，調(diào)控擬南芥表皮毛的發(fā)育[28]。茄子TTG1(WD40轉(zhuǎn)錄因子)與GL3和TT8(bHLH轉(zhuǎn)錄因子)相互作用，參與調(diào)控茄子花青素的合成[26]。楊樹MYB6與GL3和TTG1相互作用形成MBW(MYB-bHLH-WD40)復(fù)合體來正調(diào)控單寧和花青素的合成[29]。在擬南芥中，R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子GLABRA1(GL1)、bHLH轉(zhuǎn)錄因子GLABRA3/ENHANCER OF GLABRA3(GL3/EGL3)和WDR蛋白TRANSPARENTTESTAGLABRA1(TTG1)構(gòu)成MBW轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，激活GLABROUS2(GL2)的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)了表皮毛的發(fā)生[30]。本研究克隆得到的JrGL3基因具有與其他物種中調(diào)控花青素的bHLH類基因GL3相似的結(jié)構(gòu)，結(jié)合蛋白互作預(yù)測推測是參與核桃中花青素合成的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一。

通過低溫脅迫“遼寧8號”和“清香”核桃葉片48 h后轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析，JrGL3基因均呈現(xiàn)顯著上升趨勢。在“清香”不同組織轉(zhuǎn)錄組分析中表明，JrGL3基因在“清香”雌花、根、成熟葉、幼莖、幼葉、雄花、芽中均有表達(dá)，推測JrGL3在核桃響應(yīng)低溫脅迫方面具有顯著影響，并且推測其可能參與核桃花青素合成過程響應(yīng)低溫脅迫。其中JrGL3在雌花中表達(dá)量最高，而在雄花與成熟葉中表達(dá)量較低，說明JrGL3基因在不同組織中的表達(dá)量存在一定差異，但無組織特異性，可能與其在不同部位的功能有密切的關(guān)系。JrGL3在擬南芥中的研究比較深入，已證明其功能與花青素形成相關(guān)，而對JrGL3基因調(diào)控核桃中類黃酮和花青素途徑響應(yīng)低溫脅迫作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。