陳蓉，陳華林，徐俊，蔡曉洋，敬勇，李敏

(1.成都中醫(yī)藥大學 中藥材標準化教育部重點實驗室，四川 成都 611137；2.中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137)

因俄色葉因具有良好的“降三高”作用，部分公司已進行俄色葉的試生產(chǎn)和試銷。另外，有研究表明，俄色葉可制成俄色黃酮分子膠囊[7]、俄色-A毛囊靶向脂質(zhì)體[8]、俄色總黃酮緩釋栓劑與片劑[9]、俄色黃酮微囊[10]、俄色黃酮-β-環(huán)糊精包合物[11]、復方顆粒劑[12]等藥物，具有極高的臨床應用價值。

目前俄色葉飲片尚無標準可依，無法有效保障其質(zhì)量的穩(wěn)定性和可控性，因此建立俄色葉飲片標準顯得尤為迫切。本文通過對俄色葉飲片進行質(zhì)量研究，為全面控制俄色葉飲片質(zhì)量提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、SQP電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)、HWS型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)、ULUP-IV-10T優(yōu)普系列超純水儀(四川優(yōu)普超純科技有限公司)、ZF-90多功能暗箱式紫外透射儀(上海寶山顧村電光儀器廠)、DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)、A580型紫外可見分光光度計(翱藝儀器上海有限公司)、安捷倫1200高效液相色譜儀(DAD檢測器，安捷倫科技有限公司)。

1.2 試藥

根皮素對照品(純度≥98%，批號：wkq18032810)，根皮苷對照品(純度≥98%，批號：wkq18050407)，均由四川省維克奇生物科技有限公司提供。甲醇(賽默飛世爾科技公司，色譜純，批號：LOT145176)。甲醇(批號：2017090101)、甲酸(批號：20110510)、乙醇(批號：2017022801)、乙酸乙酯(批號：2017051201)等為分析純，均購于成都市科隆化學品有限公司。

30批俄色葉飲片由四川興盛源藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)由成都中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為薔薇科蘋果屬植物變?nèi)~海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes.和花葉海棠Malustransitoria(Batal.)Schneid.的干燥葉。其中15批采用凈制的方法炮制，另外15批采用切制的方法炮制。俄色葉飲片詳細信息見表1。

表1 俄色葉飲片樣品來源

2 方法及結果

2.1 性狀

對收集到的30批飲片的形狀、大小、色澤、表面特征、氣、味等進行研究。結果表明，不同飲片的性狀略有不同。見表2，圖1～4。

表2 凈制飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物測定結果n=3，%

圖1 凈制俄色葉(變?nèi)~海棠)

圖2 凈制俄色葉(花葉海棠)

圖3 切制俄色葉(變?nèi)~海棠) 圖4切制俄色葉(花葉海棠)

凈制飲片葉易皺縮，完整者呈卵形或橢圓形，先端漸尖或急尖，邊緣鈍鋸齒或微鋸齒，常具不規(guī)則3～5個深裂，亦有不裂。上表面多為暗綠色或淺棕綠色，疏被柔毛；下表面多為灰綠色或灰棕色，被柔毛，葉脈尤甚；葉柄被柔毛。質(zhì)脆。氣微香，味微苦。見圖1～2。

切制飲片為不規(guī)則碎片，葉片暗綠色。見圖3～4。

2.2 鑒別

2.2.1 顯微鑒別

通過對兩種飲片的葉中脈橫切面及粉末進行觀察和測量，其顯微鑒別特征總結如下。葉中脈橫切面：上下表皮各1列細胞，排列緊密，切向延長，可見單細胞非腺毛；葉肉為異面葉型，柵欄細胞1～3列，短柱狀，呈橙黃色,排列較整齊，不通過主脈，海綿組織疏松，細胞內(nèi)含草酸鈣方晶和簇晶；主脈向下突出，維管束外韌型，環(huán)狀，外圍有纖維束，其周圍薄壁細胞含草酸鈣方晶和簇晶，形成晶纖維(見圖5～6)。粉末：棕綠色至黃綠色，上表皮細胞多角形、狹長形或方形；下表皮有多數(shù)單細胞非腺毛，常彎曲，長130～800 μm，氣孔不定式，保衛(wèi)細胞直徑3～13 μm，副衛(wèi)細胞4～8個；草酸鈣簇晶散在薄壁組織中，直徑為2～29 μm；草酸鈣方晶的直徑為2～24 μm；纖維成束，周圍薄壁細胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維；導管為梯紋或螺紋，直徑2～20 μm。見圖7。

1.上表皮 2.柵欄細胞 3.木質(zhì)部 4.海綿組織 5.下表皮 6.非腺毛 7.韌皮部 8.纖維 9.皮層

1.非腺毛 2.木質(zhì)部 3.上表皮細胞 4.柵欄組織 5.海綿組織 6.下表皮 7.韌皮部 8.纖維 9.皮層

1.非腺毛 2.上表皮細胞 3.下表皮細胞及氣孔 4.晶纖維 5.簇晶 6.方晶 7.螺紋導管 8.梯紋導管

2.2.2 薄層鑒別

根據(jù)《四川藏藥材標準》(2014年版)俄色葉項下的薄層鑒別方法，取根皮素適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對照品溶液。以硅膠G薄層板為吸附板，以氯仿-甲醇-甲酸(8∶2∶0.1)為展開劑，以三氯化鋁試液為顯色劑。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同淺藍色熒光斑點。見圖8。

注：1～8為凈制俄色葉；9～15為切制俄色葉；S為根皮素對照品

2.3 檢查

2.3.1 水分

稱取俄色葉飲片粉末約2.0 g，照《中國藥典》2015年版(四部)通則0832項下水分測定法第二法進行測定。結果表明，15批凈制飲片水分為6.88%～10.16%，平均為9.05%；切制飲片測定結果為7.01%～10.23%，平均為9.11%。詳見表2～3。

表3 切制飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物測定結果 n=3，%

2.3.2 灰分

稱取俄色葉飲片粉末約4.0 g，按照《中國藥典》2015年版(四部)通則2302灰分測定法進行總灰分和酸不溶性灰分的測定。結果表明，凈制飲片總灰分為5.24%～6.37%，平均為5.80%；切制飲片為5.33%～6.17%，平均為5.82%。凈制飲片酸不溶性灰分為0.36%～0.48%，平均為0.42%；切制飲片為0.33%～0.47%，平均為0.42%。詳見表2～3。

2.4 浸出物

稱取俄色葉飲片粉末約2.0 g，精密稱定，按照《中國藥典》2015年版(四部)通則2201醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定，用80%乙醇作溶劑。結果表明，凈制飲片浸出物為41.08%～44.49%，平均為43.02%；切制飲片測定結果為41.67%～43.92%，平均為42.72%。詳見表2～3。

2.5 含量測定

2.5.1 總黃酮含量測定

參照《四川省藏藥材標準》(2014年版)俄色葉總黃酮測定方法進行測定，總黃酮含量以根皮苷計。結果表明，凈制飲片總黃酮含量為20.64%～25.95%，平均為22.93%，切制飲片總黃酮含量為20.77%～24.97%，平均為22.69%。詳見表4。

2.5.2 根皮素

參照《四川省藏藥材標準》(2014年版)中俄色葉根皮素測定方法進行測定。結果表明，15批凈制飲片根皮素含量為0.170%～0.503%，平均為0.234%；切制飲片中根皮素含量為0.171%～0.498%，平均為0.229%。詳見表4。

表4 俄色葉飲片含量測定結果 n=3，%

2.6 工藝研究

2.6.1 俄色葉炮制方法對質(zhì)量的影響

依據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015年版)和《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》(2015年版)對飲片凈制工藝的相關要求，以及目前飲片生產(chǎn)企業(yè)對于俄色葉凈制的操作與要求，取干燥的俄色葉藥材分別進行凈制和切制的處理。將凈制俄色葉和切制俄色葉各5批分別進行水分、總灰分、浸出物、總黃酮、根皮素含量測定，觀察俄色葉炮制方法對其質(zhì)量的影響。結果表明，切制俄色葉較凈制飲片水分略有升高，總灰分、浸出物、總黃酮和根皮素均略有降低，對酸不溶性灰分無影響。詳見表5。

表5 不同炮制方法對俄色葉飲片質(zhì)量的影響 %

2.7 穩(wěn)定性實驗

取模擬上市包裝的凈制俄色葉和切制俄色葉中試樣品各3批(批號：170101、170102、170103、170101q、170102q、170103q)進行加速試驗和長期試驗考察。

2.7.1 加速試驗

取模擬上市包裝的俄色葉和切制俄色葉中試樣品各3批，置于溫度(40±2)℃，濕度(75±5)%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進行貯藏，在0，1，2，3，6個月取樣，對飲片的性狀進行觀察，并測定水分、浸出物、總黃酮以及根皮素含量。2種飲片共6批樣品經(jīng)6個月考察發(fā)現(xiàn)，水分、總黃酮及根皮素含量無明顯變化，符合質(zhì)量標準要求，浸出物從第2月開始出現(xiàn)明顯較低的現(xiàn)象，到第6月時，兩種飲片浸出物的損失率分別達15.1%和14.05%，但均符合質(zhì)量標準要求。詳見圖9。

注：1.水分 2.浸出物 3.總黃酮 4.根皮素

2.7.2 長期試驗

取上市包裝的凈制飲片和切制飲片各3批，置于室溫(25±2)℃，濕度(60±5)%的條件下貯藏，在0，1，2，3，6，12，18，24個月進行取樣，對飲片的性狀進行觀察，并測定水分、浸出物、總黃酮以及根皮素含量。2種飲片共6批樣品經(jīng)24個月考察發(fā)現(xiàn)，水分、浸出物、總黃酮及根皮素含量均符合質(zhì)量要求，到第24月時，兩種飲片浸出物的損失率分別達12.94%和14.02%，但均符合質(zhì)量標準要求。詳見圖10。

注：1.水分 2.浸出物 3.總黃酮 4.根皮素

3 結論

本文通過對俄色葉飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、總黃酮含量以及根皮素含量進行研究，根據(jù)各項檢測結果，擬定俄色葉飲片水分不得過11.0%，總灰分不得過7.0 %，酸不溶性灰分不得過0.5%，浸出物不得少于34.0 %。按干燥品計算，總黃酮以根皮苷(C21H24O10)計，不得少于18.0%，根皮素(C15H14O5)含量不得少于0.18%。

4 討論

飲片是中藥配方顆粒、中藥湯劑、中成藥的直接原料藥，其質(zhì)量的好壞直接影響到三大產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，飲片的質(zhì)量控制顯得至關重要。

俄色葉芽與俄色大葉的根皮素含量差異較大，研究發(fā)現(xiàn)俄色葉芽根皮素含量較大葉高，尤以5月份初生的葉芽根皮素含量最高，均值可達1.516%，而大葉根皮素含量平均僅為0.218%，二者均值差異達近7倍?！端拇ㄊ〔厮幉臉藴省?2014年版)俄色葉標準中規(guī)定根皮素含量不得少于0.35%，但在實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，約60%的俄色葉藥材根皮素含量低于0.35%，這些含量較低的俄色葉中約97%的樣品為俄色大葉。根據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，“俄色樹”每年5月開始抽出葉芽，因葉芽采摘難度大，量比較小，且十分昂貴，因此常被制作成茶葉進行銷售。而當6～8月份時，葉芽較少，主要采集俄色大葉，以作藥用。因此俄色葉藥材資源以6～8月份采摘的俄色大葉為主。為保證俄色葉資源的有效利用，故擬定俄色葉凈制和切制飲片的根皮素含量均不得少于0.18 %。

加工炮制中凈選是確保中藥質(zhì)量和臨床用藥準確性的一個首要環(huán)節(jié)，而切制是便于包裝、促進有效成分溶出的一種重要手段。通過挑除俄色葉藥材中所混的枝梢、枯葉、枝梗等雜質(zhì)，提高藥材的品質(zhì)，形成凈制俄色葉飲片；取用凈制后的俄色葉切碎、包裝，形成切制俄色葉飲片。通過分析兩種炮制方式對俄色葉飲片質(zhì)量和成品率的影響，評價炮制方式是否合適。

根據(jù)加速試驗和長期試驗的結果，凈制俄色葉和切制俄色葉的外觀性狀及水分、總黃酮以及根皮素含量無明顯變化，各項指標均符合其質(zhì)量標準，說明這兩種飲片在常溫條件下質(zhì)量穩(wěn)定，在常溫條件下可貯藏24個月。

本文首次對不同基原、不同批次的兩種俄色葉飲片從外觀性狀、顯微特征、薄層色譜、水分、灰分、浸出物、總黃酮以及根皮素含量等進行了研究，擬定了俄色葉飲片質(zhì)量控制指標，為俄色葉飲片質(zhì)量標準的制定奠定了基礎，能夠有效保障俄色葉飲片質(zhì)量的穩(wěn)定、可控，同時也為俄色資源的進一步開發(fā)利用提供了科學支撐。