陳 程，董 磊，黃 歡

武漢市紅十字會醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430015

腦膠質(zhì)瘤是常見的源自神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的原發(fā)性顱腦腫瘤，由于腦膠質(zhì)瘤不同病理學(xué)級別患者的臨床治療方案存在較大差別，且預(yù)后差異也較大，故治療前準(zhǔn)確判斷其惡性程度并分級治療，對改善預(yù)后至關(guān)重要。磁共振成像（magnetic resonance image，MRI）彌散張量成像（diffusion tensor image，DTI）可通過水分子彌散運(yùn)動情況評估腫瘤組織病理微觀特征，能夠彌補(bǔ)常規(guī)MRI的不足［1］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促進(jìn)腫瘤血管新生，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）可調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附能力，破壞血管內(nèi)皮屏障，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、侵襲。既往研究［2］證實(shí)VEGF、MMP-9均與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、進(jìn)展、局部浸潤有關(guān)。有研究［3-4］表明，DTI定量參數(shù)有助于腦膠質(zhì)瘤病理學(xué)分級診斷。目前未見DTI定量參數(shù)與腫瘤組織中VEGF、MMP-9表達(dá)相關(guān)性的研究報(bào)道。本研究旨在探討DTI定量參數(shù)與腦膠質(zhì)瘤組織中VEGF、MMP-9表達(dá)的相關(guān)性及其對腦膠質(zhì)瘤術(shù)前分級診斷價(jià)值，以期為腦膠質(zhì)瘤臨床治療方案的制訂及預(yù)后評估提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2020年10月武漢市紅十字會醫(yī)院收治的204例腦膠質(zhì)瘤患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 臨床癥狀表現(xiàn)為惡心、頭痛、癲癇、嘔吐等，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為腦膠質(zhì)瘤；② 接受MRI和DTI檢查，受檢7 d內(nèi)行手術(shù)治療；③ 術(shù)前無放化療接受史；④ 年齡＞18周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 免疫、內(nèi)分泌、血液系統(tǒng)疾病者；② 伴其他良惡性腫瘤者；③ 伴精神疾病或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腦部疾病者；④ 感染性疾病者；⑤ 臨床資料不完整者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）腫瘤病理學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)［5］將患者分為低級別組94例（Ⅰ級34例、Ⅱ級60例），其中，男性54例，女性40例；年齡23～78歲，平均（55.8±14.4）歲；體重指數(shù)18～28 kg/m2，平均（23.2±5.7）kg/m2。高級別組110例（Ⅲ級64例、Ⅳ級46例），其中，男性5 8例，女性5 2例；年齡2 5～79歲，平均（56.2±14.7）歲；體重指數(shù)19～29 kg/m2，平均（23.3±5.6）kg/m2。兩組患者一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 DTI檢查

采用荷蘭Philips公司的Ingenia 3.0 T MRI掃描儀，先常規(guī)行MRI平掃檢查。軸位T1液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)（fluid-attenuated inversion recovery，F(xiàn)LAIR）序列：矩陣=320×256，回波時(shí)間（echo time，TE）/重復(fù)時(shí)間（repetition time，TR）=25 ms/2 200 ms，反轉(zhuǎn)時(shí)間/翻轉(zhuǎn)角度=850 ms/90°；T2加權(quán)成像（T2-weighted image，T2WI）：矩陣=320×256，TE/TR=120 ms/6 000 ms；T2 FLAIR：層厚=5 mm，TE/TR=160 ms/7 500 ms，矩陣=320×256，反轉(zhuǎn)時(shí)間=2 500 ms。DTI檢查應(yīng)用單次激發(fā)平面回波自旋序列（echo planner imaging-spin echo，EPISE），檢查參數(shù)：TE/TR=100 ms/8 000 ms，層厚=5 mm，b1值=0 s/mm2，b2值=1 000 s/mm2，矩陣=128×128，層間隔=0，視野（field of view，F(xiàn)OV）=240 mm×240 mm，回波次數(shù)=2，彌散梯度場選擇施加在不同的25個方向上。將EPI-SE圖像傳至服務(wù)器，通過DTI專業(yè)軟件（Functool 4.5）完成后處理，獲取表觀彌散系數(shù)（apparent diffusion coefficient，ADC）、各向異性分?jǐn)?shù)（fractional anisotropy，F(xiàn)A）等參數(shù)圖，選擇感興趣區(qū)（腫瘤實(shí)質(zhì)信號均勻區(qū)），均取測量3次的均值，定量測定ADC值、FA值、相對ADC（rADC）及相對FA（rFA）值、相對軸向彌散系數(shù)（relative axial diffusivity，rAD）值（相對值即實(shí)質(zhì)區(qū)參數(shù)值/對應(yīng)健側(cè)區(qū)參數(shù)值）。

1.2.2 腫瘤組織中VEGF、MMP-9水平檢測

收集所有患者經(jīng)手術(shù)切除的腫瘤組織，石蠟包埋、切片（4 μm）、脫蠟，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，再加入枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行熱修復(fù)，室溫下加VEGF、MMP-9抗體（二者均為鼠抗人抗體，福州邁新生物技術(shù)公司），4 ℃過夜，溫育完成后二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色、復(fù)染（蘇木精）、脫水、封片（中性樹膠）。陽性對照由試劑盒配套提供，陰性對照用磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate buffered saline，PBS）。隨機(jī)提取5個高倍鏡視野（×400），VEGF、MMP-9陽性細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)染色呈棕黃色，通過免疫組織化學(xué)定量積分判斷結(jié)果［6］：①染色強(qiáng)度評分，無陽性染色0分，淺黃色1分，黃色2分，棕黃色3分。② 陽性細(xì)胞比率，＜10%為0分，10%～25%為1分，25%～50%為2分（不含25%），50%～75%為3分（不含50%），＞75%為4分。以評分①和評分②的乘積判定：0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽性（+），5～8分為中陽性（++），≥9分為強(qiáng)陽性表達(dá)（+++）。

1.3 觀察指標(biāo)

① 比較兩組DTI定量參數(shù)（ADC、rADC、rAD、FA、rFA值）；② 比較兩組腫瘤組織中VEGF、MMP-9水平；③ 分析DTI定量參數(shù)對腦膠質(zhì)瘤術(shù)前分級診斷價(jià)值；④ 分析DTI定量參數(shù)與腫瘤組織中VEGF、MMP-9水平的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，等級資料采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估診斷效能，曲線下面積（area under curve，AUC）為0.7～0.9提示具有一定診斷準(zhǔn)確度；相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組DTI定量參數(shù)比較

高級別組DTI定量參數(shù)rADC、ADC、rAD、FA、rFA值均低于低級別組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。高級別與低級別腦膠質(zhì)瘤影像學(xué)表現(xiàn)及病理學(xué)圖片見圖1、2。

圖1 典型病例1（患者，女性，57歲，左側(cè)額葉低級別膠質(zhì)瘤，WHO Ⅱ級）影像圖及病理學(xué)表現(xiàn)

表1 兩組DTI定量參數(shù)比較 ±s

組別 n rADC ADC×10-3/（mm2·s-1） rAD FA rFA低級別組 94 1.89±0.39 1.47±0.31 1.16±0.28 0.17±0.05 0.31±0.11高級別組 110 1.60±0.44 1.23±0.32 0.98±0.23 0.11±0.03 0.21±0.06 t值 3.507 3.736 3.595 6.231 5.533 P值 0.001 0.000 0.001 0.000 0.000

圖2 典型病例2（患者，女性，60歲，右側(cè)顳葉膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，WHO Ⅳ級）影像圖及病理學(xué)表現(xiàn)

2.2 兩組腫瘤組織中VEGF、MMP-9水平比較

高級別組腫瘤組織中VEGF、MMP-9陽性表達(dá)率均高于低級別組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2及圖1、2）。

表2 兩組腫瘤組織中VEGF、MMP-9水平比較 n（%）

2.3 DTI定量參數(shù)對腦膠質(zhì)瘤術(shù)前分級診斷價(jià)值

ROC曲線分析顯示：DTI定量參數(shù)rADC、ADC、rAD、FA、rFA診斷腦膠質(zhì)瘤術(shù)前分級的AUC分別為0.701、0.719、0.704、0.794、0.789，均有一定診斷準(zhǔn)確度（P均＜0.05，表3，圖3）。

圖3 DTI定量參數(shù)對腦膠質(zhì)瘤術(shù)前分級診斷的ROC曲線

表3 DTI定量參數(shù)診斷腦膠質(zhì)瘤術(shù)前分級的ROC曲線分析結(jié)果

2.4 DTI定量參數(shù)與腫瘤組織中VEGF、MMP-9水平的相關(guān)性

Spearman分析顯示：DTI定量參數(shù)rADC、ADC、rAD、FA、rFA與腫瘤組織中VEGF、MMP-9表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05，表4）。

表4 DTI定量參數(shù)與腫瘤組織中VEGF、MMP-9水平的相關(guān)性

3 討 論

DTI技術(shù)可顯示體內(nèi)水分子運(yùn)動方向、位移等細(xì)微特征，量化評估分子彌散的各向異性數(shù)據(jù)，通過三維角度定量測定彌散情況，常用定量參數(shù)包括ADC、FA、AD等。ADC反映分子彌散位移強(qiáng)度，評估細(xì)胞間隙分子彌散情況。FA反映腦白質(zhì)纖維完整性、神經(jīng)纖維密度、彌散方向。目前，部分研究證實(shí)了ADC、FA與腫瘤生物學(xué)特性的關(guān)系，李論等［7］研究表明，DTI定量參數(shù)FA有助于腦膠質(zhì)瘤的術(shù)前分級評估，而不同病理學(xué)分級患者ADC、rADC對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；蔡志超等［8］研究發(fā)現(xiàn)，瘤體ADC在不同級別膠質(zhì)瘤患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而FA無明顯差異。徐慧琳等［9］的研究表明，DTI定量參數(shù)可用于腦膠質(zhì)瘤病理學(xué)分級診斷，且與VEGF表達(dá)、Ki-67增殖指數(shù)密切相關(guān)。鑒于目前研究結(jié)論不一，并且缺乏DTI定量參數(shù)與腫瘤組織學(xué)相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析，故本研究結(jié)合DTI定量參數(shù)與腫瘤組織中VEGF、MMP-9表達(dá)的相關(guān)性分析來評估DTI定量參數(shù)在腦膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，高級別組DTI定量參數(shù)rADC、ADC、rAD、FA、rFA值均低于低級別組（P＜0.05），且ROC曲線分析顯示，rADC、ADC、rAD、FA、rFA對腦膠質(zhì)瘤術(shù)前分級均有一定診斷準(zhǔn)確度（P均＜0.05）。分析認(rèn)為：① 通常情況下，腫瘤惡性度越高，相應(yīng)組織細(xì)胞密度則越高，而FA值提示各向異性程度，故FA值隨病灶惡性度增高而增大。但腦膠質(zhì)瘤具有浸潤生長特性，白質(zhì)由于遭受破壞已不具有原來正常的結(jié)構(gòu)，造成彌散各向異性出現(xiàn)降低。另一方面，考慮與神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)丟失及神經(jīng)軸突喪失了排列順序和方向性有關(guān)，使得某一特定的方向限制水分子運(yùn)動的細(xì)胞膜及髓磷脂鞘減少，導(dǎo)致病變組織水分子彌散各向異性降低［10］。② 活體組織內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、微循環(huán)等對水分子彌散均會構(gòu)成影響，從而ADC值受一定影響。由于低級別瘤的組織細(xì)胞增殖度、惡性度相比高級別瘤要低，瘤體實(shí)質(zhì)細(xì)胞成分相對少，而相應(yīng)的細(xì)胞間隙更大，因此對分子彌散更有利［11］，故rADC、ADC值增高，李章宇等［12］研究也表明，低級別膠質(zhì)瘤瘤體的rADC值高于高級別膠質(zhì)瘤。③ 隨腦膠質(zhì)瘤級別增加，細(xì)胞密度、數(shù)量增加，多核細(xì)胞構(gòu)成比增加，核異型性增大，造成實(shí)質(zhì)循環(huán)中限制分子彌散，腫瘤實(shí)質(zhì)軸向彌散在高級別瘤中受限更加明顯，故rAD值更低［13］。

VEGF是影響血管通透性的血管生成刺激因子，腦膠質(zhì)瘤病理生理過程中組織缺血缺氧可刺激VEGF分泌，VEGF又可參與腫瘤血管新生，影響腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移。MMP-9可調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附，破壞腫瘤周圍基質(zhì)及血管內(nèi)皮屏障，促細(xì)胞生長、侵襲。既往研究［14-15］證實(shí)，VEGF、MMP-9隨腦膠質(zhì)瘤分級增加而陽性表達(dá)增加，甚至出現(xiàn)片塊狀陽性分布；二者與腦膠質(zhì)瘤惡性度有關(guān)，可作為生物學(xué)指標(biāo)用于臨床評估。本研究結(jié)果顯示，高級別組腫瘤組織中VEGF、MMP-9陽性表達(dá)率均高于低級別組（P＜0.05），且Spearman分析顯示，DTI定量參數(shù)rADC、ADC、rAD、FA、rFA與腫瘤組織中VEGF、MMP-9表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），隨著VEGF、MMP-9表達(dá)升高，腦膠質(zhì)瘤DTI定量參數(shù)值隨之降低，提示DTI定量參數(shù)與腫瘤組織中VEGF、MMP-9表達(dá)具有相關(guān)性。分析其具有相關(guān)性的病理生理學(xué)基礎(chǔ)是VEGF、MMP-9能促進(jìn)腫瘤血管的生成，VEGF、MMP-9可調(diào)控血管生成進(jìn)而影響腫瘤生物學(xué)變化（腫瘤分化、進(jìn)展、侵襲等），與腦膠質(zhì)瘤分級、惡性程度、周圍水腫、血管新生等關(guān)系密切；腦膠質(zhì)瘤侵犯周圍腦組織，出現(xiàn)水腫、惡化等病理生理狀態(tài)下，會促使周圍腦組織、神經(jīng)纖維束的水分子彌散運(yùn)動和各向異性產(chǎn)生轉(zhuǎn)變［16］。

綜上所述，DTI定量參數(shù)與腦膠質(zhì)瘤組織中VEGF、MMP-9水平具有一定相關(guān)性，且DTI定量參數(shù)有助于腦膠質(zhì)瘤術(shù)前分級診斷，可為腦膠質(zhì)瘤臨床治療及預(yù)后評估提供更為客觀的影像學(xué)依據(jù)。由于受樣本量限制，本研究未對各病理學(xué)分級進(jìn)行細(xì)化分析，接下來將進(jìn)一步探索多參數(shù)彌散成像以及對不同級別、不同細(xì)胞類型的膠質(zhì)瘤進(jìn)行分層研究。