周賢敏，區(qū)燦盛，鄧森榮，楊賽亞，張學(xué)武，曾巧輝*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528225）（2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19），簡稱為“新冠肺炎”[1]，是人類和動物感染新型冠狀病毒（2019-nCoV）而引起嚴重的呼吸道感染疾病[2]，2019 年12 月在中國武漢發(fā)現(xiàn)[3]，2020年1 月世界衛(wèi)生組織緊急委員會宣布中國爆發(fā)疫情，被認為是國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件[4]，快速傳播的特征導(dǎo)致其在全球廣泛流行，并成為全球關(guān)注的問題[3]。查看霍普金斯大學(xué)研發(fā)的在線網(wǎng)站[5]，截止2021年3 月28 日，新冠病毒已奪走2778682 人的生命，涉及192 個國家/地區(qū)。目前，雖然已經(jīng)開發(fā)出新型冠狀病毒滅活疫苗和減毒疫苗，但是仍然沒有治療新冠肺炎的特效藥，也缺乏關(guān)于新冠肺炎治療的調(diào)查[4]。據(jù)Michael 等[6]的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)至少有50%的新冠感染來自接觸無癥狀感染者。新冠肺炎的廣泛傳播主要是由于沒有或輕微癥狀的人推動，但他們沒有被認為是新冠肺炎患者，結(jié)束新冠肺炎全球大流行的關(guān)鍵在于無癥狀或輕微癥狀的傳播[7]。Mpro是冠狀病毒的主要蛋白酶，抑制該酶的活性可以阻止病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，是SARS-CoV-2 最具特征的有效藥物靶標[8-9]。研究人員開始利用分子對接分析來研究一些常見的植物蛋白質(zhì)抑制SARS-CoV-2 Mpro的潛力[10]。

優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)是COVID-19 潛在感染者和患者的重要營養(yǎng)補充劑。蛋白質(zhì)是構(gòu)成人體組織細胞的主要成分，對于維持機體的正常免疫功能、防御病毒感染有至關(guān)重要的作用。花生（Arachis hypogaea）含有豐富的蛋白質(zhì)[11]，廣泛種植于亞洲、非洲、美洲等地區(qū)[12]，我國花生種植資源豐富，產(chǎn)量穩(wěn)居世界第一[13]?；ㄉ鞍踪|(zhì)中含有八種人體所必需的氨基酸，其中天門冬氨酸、谷氨酸含量高于其他糧油作物，具有較高的營養(yǎng)價值[14]，且有效利用率高[15]。

新的藥品研發(fā)需要大量的時間[16]，疫苗生產(chǎn)到全球接種也需要漫長的時間，在這種情況下，補充優(yōu)質(zhì)蛋白以增強新冠病毒潛在感染者的體質(zhì)是關(guān)鍵，同時藥物治療輔以營養(yǎng)補充劑的方式可能會幫助患者更好地恢復(fù)健康[2]。花生產(chǎn)量多且蛋白質(zhì)含量高，人們以其多肽研制抑制劑和營養(yǎng)補充劑已有先例[17]?；ㄉ鞍椎慕M成及分類的研究眾說紛紜，根據(jù)不同的原理會有不同的分類方法。本文首先對花生蛋白的分類進行簡要綜述，篩選出花生中所含的代表性蛋白，通過計算機模擬胃腸道對花生蛋白進行水解，得到的低聚肽（2≤肽段長度≤5）與SARS-CoV-2 Mpro結(jié)合。通過對接分數(shù)來預(yù)測花生作為營養(yǎng)補充劑同時增強潛在感染者體質(zhì)的潛力。

1 花生蛋白的分類

目前國內(nèi)外以花生蛋白的組成及分類為研究的報道眾多，但結(jié)果并不一致，沒有明確的分類界線，根據(jù)不同的原理會有不同的分類方法。

最常見的分類是按照溶于的物質(zhì)不同進行分類，分為水溶蛋白和鹽溶蛋白。水溶蛋白也稱清蛋白，占總蛋白的10%左右，主要由兩個分子量為15 ku、19 ku的蛋白組成，他們的胱氨酸二硫鍵主要存在于肽鏈中[18]。鹽溶蛋白是世界研究的熱點，它亦稱球蛋白，主要由儲藏性蛋白組成，占全蛋白的87%～90%，分為花生球蛋白（arachin）和伴花生球蛋白（conarachin）?；ㄉ虻鞍?，分子量為600 ku，占總蛋白的23.8%[18]，國內(nèi)外對花生球蛋白組成的研究報道眾多，大多數(shù)在花生球蛋白主要由花生球蛋白I 和花生球蛋白II 組成這一觀點達到一致，但還存在一些爭論，主要討論點在于含有的亞基數(shù)量是6 個還是12 個甚至更多；不同種花生品種的花生還會得到不同的亞基數(shù)目，國內(nèi)外一些實驗總結(jié)其有4 種花生球蛋白不同亞基模式[19-20]。Bland 等[21]研究發(fā)現(xiàn)花生球蛋白I 是由兩個相同分子量為180 ku 的亞基組成的二聚體。Mouecoucou等[22]對花生球蛋白進行實驗，β-巰基乙醇、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）處理，結(jié)果展示其分子質(zhì)量為350 ku，并得到分子量分別為72.4 ku、60.3 ku、39.8 ku、33.1 ku、29.0 ku、21 ku 的6 個亞基蛋白。楊曉泉等[23]把花生球蛋白用SDS-PAGE 處理后發(fā)現(xiàn)其由三個分子量為（40.5 ku、37.5 ku 及19.5 ku）；用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（2D-PAGE）處理后發(fā)現(xiàn)其由2 個酸性亞基（40.5 ku、pI5.5，37.5 ku、pI 5.0）和3個堿性亞基（19.5 ku，pI 6.3、7.0、8.2）組成。Yamada等[24]的研究研究結(jié)果與楊曉泉等[23]基本相同，他們證實了花生球蛋白由6 個亞基組成，其中3 個亞基是酸性的且分子量較大，剩下的3 個分子量較小的亞基是堿性的。伴花生球蛋白也分為I 和II 兩種，伴花生球蛋白I 占總蛋白的30%，主要由分子量分別為12.5、13、14、15.5、16.5 和17 ku 的6 個亞基組成；伴花生球蛋白 II 由 6～8 個亞基組成，占總蛋白的15%～25%[23]。鹽溶蛋白還有一種分類，分為酸溶性蛋白和堿溶性蛋白，前者由三個分子量為97 ku、77 ku、20 ku 的蛋白組成，蛋白鏈之間的胱氨酸含量最少；后者也是由三個蛋白組成，分子量分別為97 ku、30 ku、17 ku，蛋白鏈之間存在最多的二硫鍵[25-26]。

花生蛋白中的可溶性蛋白還可以根據(jù)其沉降系數(shù)分為2 s、5 s、9 s、14 s、19 s。2 s 蛋白由六個分子量分別為12.5、13、14、15.5、16.5 和17 ku 的亞基組成；2 s 和5 s 蛋白里含有許多種蛋白，但都不含花生球蛋白I 和伴花生球蛋白II；9 s 蛋白大部分由伴花生球蛋白II 組成；14 s 大部分由花生球蛋白組成；19 s 一般由可溶性的花生球蛋白的聚合物組成[27]。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織和國際免疫學(xué)會聯(lián)合會過敏原命名小組委員會批準的系統(tǒng)過敏原命名法，花生蛋白還可分為Ara h1-17，后來發(fā)現(xiàn)Ara h3 和Ara h4 是相同的過敏原，因此都被稱為Ara h3。其中Ara h1、Ara h2、Ara h3 和Ara h6，這四種過敏原蛋白是花生中含量最豐富的蛋白質(zhì)，它們都是種子貯藏蛋白[28]。

通過查閱文獻對花生蛋白的組成進行簡單綜述，了解到系統(tǒng)過敏原命名法中Ara h1、Ara h2、Ara h3和Ara h6 是花生中含量最豐富的種子貯藏蛋白質(zhì)，伴花生球蛋白含量占花生總蛋白的45%～55%，因此選用Ara h1、Ara h2、Ara h3、Ara h6、伴花生球蛋白A（序列號：AEL30377.1）、伴花生球蛋白B（序列號：AAU21493.1 ）（數(shù)據(jù)來源于NCBI數(shù)據(jù)庫https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行模擬對接[29-30]。

圖1 花生蛋白的組成和分類Fig.1 Composition and classification of Arachis hypogaeaproteins

2 材料和方法

2.1 計算機模擬胃腸酶的水解

使用BIOPEP-UWM 數(shù)據(jù)庫的三種胃腸道蛋白酶（胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶）對上述的6種花生蛋白進行水解[29-30]，理論水解度（TDH）的計算公式如下：

D——氫的數(shù)目；

D——蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)。

2.2 分子的對接及其能力評價

用HPEPDOCK（http://huanglab.phys.hust.edu.cn /hpepdock/）將6 種花生蛋白質(zhì)用胃腸道蛋白酶水解后釋放的含有少數(shù)氨基酸的寡肽連接到SARS-CoV-2 Mpro（PDB 代碼6LU7）上[32]，結(jié)合評分低于-110 的寡肽被認為是高親和力寡肽。通過蛋白所含高親和寡肽的頻率（F）來評估花生蛋白作為營養(yǎng)補充劑的能力：

F——出現(xiàn)頻率；

N——蛋白鏈內(nèi)高親和寡肽的數(shù)量；

L——蛋白鏈的長度。

用 PyMol[33]（https://www.lfd.uci.edu/～gohlke/ pythonlibs/#pymol）處理受體和配體、LigPlot+[34]（版本號：V.2.2）來檢測高親和力寡肽與SARS-CoV-2 Mpro對接結(jié)果的氫鍵以及殘基。

3 結(jié)果與討論

3.1 模擬胃腸酶的水解

表1 花生中高親和力寡肽與SARS-CoV-2 Mpro結(jié)合的序列和頻率Table 1 Sequences and frequencies of high affinity oligopeptides binding to SARS-CoV-2Mpro from Arachis hypogaea

三種胃腸酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）對花生中6 種蛋白質(zhì)進行水解（圖2）。結(jié)果表明，TDH 均在34.97%～38.11%，水解產(chǎn)物主要為寡肽（2≤肽段長度≤5），少數(shù)為多肽（肽段長度＞5）。其中，水解程度較高的是：伴花生球蛋白A（38.11%）、Arah1（36.97%）、Arah3（36.88%）和伴花生球蛋白B（36.22%）。上述TDH與Luo 等[2]研究模擬植物蛋白水解的理論水解度相似。同時，Arah1 產(chǎn)生的寡肽（126）最多，其次是伴花生球蛋白B（122）、Arah3（99）。

圖2 花生蛋白質(zhì)的計算機模擬水解Fig.2 Computer simulation of hydrolysis of Arachis hypogaea protein

3.2 寡肽與SARS-CoV-2 Mpro 的結(jié)合能力

寡肽可以在蛋白水解或發(fā)酵過程中釋放，并通過影響消化、內(nèi)分泌等系統(tǒng)在人類健康發(fā)揮重要作用，對身體功能或狀況產(chǎn)生影響[35]。二肽和三肽的寡聚體轉(zhuǎn)運是耗能、飽和載體的運輸過程，二肽的攝入是由水離子攜帶，肽的消化吸收作用也可通過簡易擴散來進行，使高濃度肽在體外運轉(zhuǎn)產(chǎn)生重要作用[36]。人們普遍認為，二肽和三肽在腸道中通過PepT1 或PepT2特定的肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)就很容易被吸收[37]，而四肽和五肽也可以通過細胞旁緊密連接途徑轉(zhuǎn)運[38]。因此對接SARS-CoV-2 Mpro的寡肽，選用被胃腸蛋白酶酶解后肽鏈長度為2～5 的短肽。

用HPEPDOCK 將上述寡肽與SARS-CoV-2Mpro（PDB 代碼6LU7）對接。結(jié)合分數(shù)≤-110 被認為是高親和力肽，這里參考Luo 等[2]在植物蛋白作為新冠肺炎患者營養(yǎng)補充劑的潛力中的研究，他們把結(jié)合分數(shù)≤-100 認為具有高親和力。用F 值（公式2）來評價花生蛋白抑制SARS-CoV-2Mpro的能力。結(jié)果顯示，Arah2的F 值最大（6.67%），其次是Arah6（4.73%）、伴花生球蛋白A（4.00%）、Arah3（3.58%）、Arah1（3.35%），伴花生球蛋白B（2.87%）。其中伴花生球蛋白B 的F值最小（2.87%）。

表2 顯示對接分數(shù)≤-140 的寡肽，他們被認為是超高親和力寡肽?？傆嬘? 個寡肽達到此分數(shù)，一個（PCAQR）來自Arah1，一個（IQQGR）來自Arah3，CQSQL、PCEQH 都來自Arah2 和Arah6。結(jié)合分數(shù)最高的寡肽是PCEQH（-153.98）來自Arah2 和Arah6，其次是IQQGR（-151.44），來自Arah3。

表2 花生蛋白與SARS-CoV-2 Mpro結(jié)合的超高親和力寡肽Table 2 Ultra-highaffinity oligopeptides binding to the SARS-CoV-2-Mpro from Arachis hypogaeaprotein

3.3 超高親和力寡肽與SARS-CoV-2Mpro 的對接

根據(jù)以上的結(jié)果顯示，對SARS-CoV-2 Mpro具有超高親和力的肽一共有四個（PCAQR、CQSQL、PCEQH、IQQGR）。SARS-CoV-2 Mpro的對接圖顯示（2D 結(jié)構(gòu)圖由LigPlot+軟件制作，版本號：V.2.2）。

由圖3a 知，SARS-CoV-2 Mpro與PCAQR 形成了五對氫鍵。其中，在酶的一邊形成氫鍵的氨基酸分別是Asp153（兩對）、Thr111、Gln110、Lys102。除此之外，還有8 個游離的殘基涉及到疏水接觸。他們分別是Asp295、Pro293、Ile249、Phe294、Ser158、Val104、Asn151、Thr292。類似的圖3b 可得，SARS-CoV-2 Mpro與CQSQL 形成了三對氫鍵，形成的氨基酸都是Thr111。13 個殘基涉及到疏水接觸，分別是Asn151、Cys156、Asp153、Lys102、Phe294、Ile249、Pro252、Pro293（兩個）、Thr292、Gln110、Leu253、Val297。圖3c 顯示，SARS-CoV-2 Mpro與PCEQH 形成了4 對氫鍵。和肽形成氫鍵的氨基酸分別是Gln110、Thr292、Thr111、Asn151，具有疏水接觸的殘基分別是Asp295、Phe294、Pro293、Ile249、Ile152、Ser158、Asp153,一共有7 個。圖3d 顯示SARS-CoV-2 Mpro與IQQGR形成了兩個氫鍵，分別是Thr111 和His246，有12 個疏水殘基，分別是Glu240、Pro108、Gly109、Gln110、Pro293、Asn203、Val202、Ile200、Thr292、Asn151、Phe294、Ile249。

圖3 低聚肽與SARS-CoV-2 MPRO結(jié)合的三維圖像和相互作用殘基Fig.3 The binding 3D image and interacting residues of oligopeptides with SARS-CoV-2-Mpro

分子模擬對接越來越多地被研究人員接受和使用，尤其是在藥物開發(fā)方面[39]。SARS-CoV-2 Mpro在介導(dǎo)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄方面起關(guān)鍵作用，使之成為SARS-CoV-2 藥物設(shè)計和篩選的重要藥物靶點。吳燦榮等[16]，對SARS-CoV-2 基因編碼的所有蛋白進行了系統(tǒng)分析，預(yù)測并構(gòu)建可以通過同源模建的結(jié)構(gòu)，基于靶點的虛擬配體篩選，建立常用抗病毒藥物的數(shù)據(jù)庫。Siti[40]等通過分子對接研究，評估在藥用植物中發(fā)現(xiàn)的生物活性化合物作為潛在的SARS-CoV-2 Mpro抑制劑。Luo 等[2]采用電子計算機方法模擬胃腸道酶對蛋白質(zhì)的水解并產(chǎn)生大量活性多肽，然后評價產(chǎn)生的多肽與SARS-CoV-2 刺激性蛋白受體結(jié)合域（RBD）的結(jié)合能力。Cristina 等[41]、Avinash 等[42]、Liu 等[43]通過不同的實驗表明較高的模擬對接分數(shù)與體外實驗結(jié)果具有良好的相關(guān)性，因此，理論上較高的對接分數(shù)可能會具有較強的生物活性。本研究發(fā)現(xiàn)，針對SARS-CoV-2 Mpro有PCEQH、IQQGR 兩種肽的抑制效果很好（得分分別為-153.98、-151.44），理論上食用花生將會給新冠病毒潛在感染者和患者提供營養(yǎng)補充，并改善新型冠狀病毒引起的肺炎癥狀。

4 總結(jié)

花生是目前理想的高蛋白食物來源，其蛋白質(zhì)具有較高的營養(yǎng)價值，且有效利用率高。本文對花生蛋白的分類進行簡要綜述，并通過計算機模擬胃腸道蛋白酶對6 種花生中所含的代表性蛋白（Ara h1、Ara h2、Ara h3、Ara h6、伴花生球蛋白A 和伴花生球蛋白B）進行水解，得到了大量的活性肽，然后，將活性肽與SARS-CoV-2 Mpro進行對接，從而評估上述6 種花生蛋白與SARS-CoV-2 Mpro的結(jié)合能力。結(jié)果表明，花生蛋白Arah2 的F 值較高（0.0667），可以作為優(yōu)質(zhì)食物來源為新冠病毒潛在感染者和患者提供營養(yǎng)和能量。篩選的多肽（PCAQR、CQSQL、PCEQH、IQQGR等）與SARS-CoV-2 Mpro晶體結(jié)構(gòu)的活性位點的結(jié)合效果較好，顯示了花生蛋白對新冠病毒主蛋白酶具有一定的抑制效果，可提取、提純后作為噴霧沖洗鼻咽喉腔，減少上呼吸道病載量，有望對醫(yī)護人員提供一定的保護。整篇文章的結(jié)果都是基于計算機虛擬篩選，篩選出的多肽是否真的對SARS-CoV-2 Mpro有效，還需要進一步驗證。