袁慶虹,楊利圭,田 杰,楊衛(wèi)紅,周濟(jì)華,楊向東,于彬彬,羅德榮,楊 蛟

嚙齒動(dòng)物是多種病原體的自然界宿主,其中許多鼠類攜帶的病原體可引起人類嚴(yán)重疾病。立克次體在自然界中廣泛存在,他們大多在嚙齒動(dòng)物宿主和傳播媒介之間循環(huán),人被攜帶立克次體的節(jié)肢動(dòng)物如螨、蜱叮咬而感染[1]。恙蟲病(Tsutsugamushi disease)又名叢林斑疹傷寒(Scrub typhus),是由恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamushi)引起的一種自然疫源性疾病。臨床上以發(fā)熱、焦痂、淋巴結(jié)腫大為特征[2],在云南的廣大農(nóng)村發(fā)病率較高。在我國(guó),黃胸鼠、褐家鼠、黃毛鼠、黑線姬鼠等嚙齒動(dòng)物為恙蟲病東方體的主要宿主[3-5]。無形體(Anaplasmaspp.)和埃立克體(Ehrlichiaspp.)主要以哺乳類、嚙齒類和有蹄動(dòng)物為宿主,經(jīng)蜱傳播,引起人類和動(dòng)物的無形體病和埃立克體病,如人單核細(xì)胞埃立克體病(Human monocytic ehrlichiosis,HME)和人粒細(xì)胞無形體病(Human granulocytic anaplasma,HGA)[6]。

瀘西縣為云南省紅河哈尼族彝族自治州下轄縣,氣候溫和,動(dòng)植物資源豐富,病原的動(dòng)物宿主和媒介生物種類也很多。該縣是流行性出血熱的自然疫源地,也是國(guó)家級(jí)的出血熱監(jiān)測(cè)點(diǎn)[7],但尚不清楚該地區(qū)嚙齒動(dòng)物的立克次體感染狀況。本研究在瀘西縣捕鼠,對(duì)其脾樣本進(jìn)行PCR檢測(cè),血清進(jìn)行抗體檢測(cè),旨在了解恙蟲病東方體、無形體和埃立克體在當(dāng)?shù)刈匀唤绲拇嬖跔顩r,為其所致疾病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 嚙齒動(dòng)物標(biāo)本采集 2015年8月至2017年9月在云南省瀘西縣居民區(qū)和野外山坡地采用鼠籠和鼠夾捕鼠。捕獲的鼠經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定并登記后,解剖取鼠脾臟器,液氮凍存待檢。其中活鼠解剖前取股動(dòng)脈血,分離血清待檢。

1.2 DNA提取和特異性基因檢測(cè) 取適量脾組織,放入乳缽內(nèi)研磨,加入無菌蒸餾水制成混懸液。根據(jù)天根DNA提取試劑盒說明書的操作方法提取樣本DNA。

采用巢氏PCR方法檢測(cè)恙蟲病東方體groEL基因,無形體和埃立克體16SrRNA基因片段。根據(jù)參考文獻(xiàn)[8-9]合成相關(guān)引物,引物由上海生工合成(表1)。

表1 立克次體檢測(cè)用引物Tab.1 Primers for detection of Rickettsia

恙蟲病東方體groEL基因檢測(cè)時(shí),第一輪 PCR采用立克次體科通用外引物Gro-1和Gro-2,PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性40 s,45℃退火40 s,72℃延伸40 s,共39個(gè)循環(huán),最后72℃4 min,產(chǎn)物為616 bp。第二輪PCR為恙蟲病內(nèi)引物TF1和TR2,反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min,94℃變 性35 s,56℃退 火35 s,72℃延 伸35 s,共39個(gè)循環(huán),最后72℃4 min,產(chǎn)生217 bp大小的條帶。無形體和埃立克體16S r RNA檢測(cè)時(shí)第一輪PCR采用無形體科通用外引物Eh-out1和Eh-out2,PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性45 s,55℃退火50 s,72℃延伸60 s,共40個(gè)循環(huán),最后72℃5 min,產(chǎn)物為653 bp。第二輪PCR分別為無形體內(nèi)引物HGA1和HGA2,埃立克體內(nèi)引物HME1和HME2,反應(yīng)條件同第一輪,均產(chǎn)生389 bp大小的條帶。取PCR產(chǎn)物5μL,用含Goldview染料的1.0%的瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.3 PCR陽(yáng)性產(chǎn)物的DNA序列測(cè)定及遺傳進(jìn)化分析 將擴(kuò)增的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。通過NCBI網(wǎng)站,利用“BLAST”工具,將測(cè)得序列與Gen Bank中注冊(cè)的DNA序列進(jìn)行同源性比較;使用MEGA7.0軟件鄰接法Neighbour-joining(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.4 鼠血清恙蟲病IgG抗體檢測(cè) 采用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)鼠血清中東方體IgG抗體,在熒光顯微鏡觀察結(jié)果。在陽(yáng)性和陰性對(duì)照均成立的情況下,根據(jù)特異性熒光的強(qiáng)弱來判定結(jié)果,以≥1∶20為陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1 捕獲嚙齒動(dòng)物種群構(gòu)成 在瀘西縣野外共計(jì)放置1 960個(gè)籠和夾次,捕獲鼠155只。居民區(qū)共計(jì)放置1 600個(gè)籠和夾次,捕獲鼠70只。其中野外以大絨鼠50.97%(79/155)、中華姬鼠20.0%(31/155)和黃胸鼠16.77%(26/155)為優(yōu)勢(shì)鼠種;居民區(qū)以黃胸鼠85.71%(60/70)為優(yōu)勢(shì)鼠種。黃胸鼠在野外和居民區(qū)均占比較高(表2)。

表2 瀘西縣嚙齒動(dòng)物種群構(gòu)成Tab.2 Composition of rodent population in LUXI County

2.2 恙蟲病、無形體及埃立克體巢氏PCR檢測(cè)結(jié)果 對(duì)225只鼠脾臟樣本進(jìn)行恙蟲病東方體groEL基因和無形體與埃立克體16S r RNA基因巢式PCR檢測(cè),5只鼠樣本檢測(cè)到恙蟲病東方體groEL基因(364 bp),分別命名為L(zhǎng)UXI10、LUXI11、LUXI13、LUXI34和LUXI164,其中2份來自黃胸鼠(2.41%,2/83)和3份 來 自 大 絨 鼠(3.80%,3/79)。另外3份鼠樣本檢出16S r RNA基因(389 bp),其中1份來自大絨鼠(LUXI150),2份來源黃胸鼠(LUXI189和LUXI134)。

2.3 鼠血清恙蟲病東方體IgG抗體檢測(cè)結(jié)果IFA檢測(cè)鼠血清中恙蟲病東方體IgG抗體,從85份鼠血清中檢出陽(yáng)性7份(8.24%)。其中黃胸鼠3份,2份來自野外捕獲鼠,1份來自居民區(qū)捕獲鼠;大絨鼠陽(yáng)性3份;中華姬鼠陽(yáng)性1份(表3)。

表3 IFA法檢測(cè)鼠血清恙蟲病東方體抗體結(jié)果Tab.3 Detection of Oriental tsutsugamushi antibody in rat serum by IFA

2.4 恙蟲病東方體groEL基因同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析 將擴(kuò)增得的5份恙蟲病東方體groEL基因片段測(cè)序,獲得基因序列LUXI11、LUXI13和LUXI34的相似性為100%,其與另外2個(gè)序列LUXI10和LUXI164的 相 似 性 為99.02%～99.68%。通過與GenBank中收錄的部分恙蟲病東方體相應(yīng)基因片段序列進(jìn)行同源性比較,發(fā)現(xiàn)本次陽(yáng)性樣本基因序列與日本姬鼠菌株(KC688332)、中國(guó)安徽省羊菌株(GQ499935)和泰國(guó)東方體菌株(EF551292)序列相似性為98.75%～100%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,本次檢出恙蟲病東方體菌株與來自日本的kato血清型株(KC688332)、泰國(guó)的UT76血清型株(EF551292)、中國(guó)安徽的東方體(GQ499935)共處于同一分支,與印度病人分離株(MG601959)、日本病人Shimokoshi血清型株(JX188395)、北京病人分離株(JQ894502)和云南鼠源株(KY987155)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖1)。

圖1 基于東方體groEL基因部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on groEL sequences of Orientia

2.5 埃立克體16SrRNA基因同源性及進(jìn)化分析3份16SrRNA基因陽(yáng)性標(biāo)本中,1份來自大絨鼠序列(LUXI150)的菌株與來自美國(guó)伊文氏埃立克體(KJ942217)和查菲埃立克體(CP007479)、中國(guó)遼寧埃立克體(EU179240)和北京查菲埃立克體(GQ499971)、巴西埃立克體(JQ260846)基因片段的序列同源性為99.71%～100%。選取不同埃立克體屬中的代表株,采用邊緣無形體(A.marginale)HM538192株作為外群,與本次LUXI150株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果該株與美國(guó)伊文氏埃立克體(KJ942217)、中國(guó)遼寧的埃立克體(EU179240)和巴西埃立克體(JQ260846)處于同一分支,而與2株犬埃立克體(GU810149和KJ513194)、2株鼠埃立克體(CP006917和AB196302)、2反芻動(dòng)物埃立克體(DQ647616和CR767821)相距較遠(yuǎn)(圖2)。

圖2 基于埃立克體16S rRNA基因部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of Ehrlichia

經(jīng)序列比較,16SrRNA基因序列(LUXI134)屬于巴爾通體;LUXI189屬于沃爾巴克體,與來自中國(guó)新疆羊皮蠅(KY224163)、南非(MF461469)、巴西(KF249460)和法國(guó)(JQ888305)的沃爾巴克氏體基因片段的序列同源性為97.93%～98.22%。

3 討 論

立克次體病是一類嚴(yán)重威脅人類健康的自然疫源性疾病,在世界范圍內(nèi)呈散發(fā)和季節(jié)性流行。對(duì)人致病的立克次體種類多,目前發(fā)現(xiàn)有20多種立克次體可對(duì)人致病,包括立克次體科中的立克次體屬、東方體屬,無形體科的無形體屬、埃里克體屬等。立克次體病原體還在不斷被發(fā)現(xiàn)[10]。我國(guó)幾乎存在世界上發(fā)現(xiàn)的所有立克次體病,恙蟲病尤其普遍[11]。立克次體病原體大多以嚙齒動(dòng)物為宿主,以節(jié)肢動(dòng)物為媒介進(jìn)行傳播,因而開展野生動(dòng)物攜帶立克次體病原的研究,從宿主動(dòng)物源頭阻止立克次體病的流行,是預(yù)防和控制疾病的有效手段。

我國(guó)嚙齒類動(dòng)物有近200種,已經(jīng)查明近80種為病原宿主[12-13]。云南省氣候溫和,溫度適宜,動(dòng)物宿主和媒介生物異常豐富,各種自然疫源性疾病高發(fā)。此次調(diào)查發(fā)現(xiàn),瀘西地區(qū)嚙齒動(dòng)物中的優(yōu)勢(shì)種為絨鼠屬、姬鼠屬和黃胸鼠。而黃胸鼠是同時(shí)活動(dòng)于居民區(qū)和野外的鼠種。對(duì)225只鼠脾臟標(biāo)本進(jìn)行巢式PCR檢測(cè),5只鼠檢出恙蟲病東方體,其中2只為黃胸鼠和3只為大絨鼠,另外1只大絨鼠檢出埃立克體,2只黃胸鼠分別檢出巴爾通體和沃爾巴克體。這幾種鼠體內(nèi)均檢測(cè)到恙蟲病東方體抗體。檢出結(jié)果表明該地區(qū)存在多種立克次體感染的混合自然疫源地,黃胸鼠為該地區(qū)最主要的病原宿主,其能夠把自然疫源地病原體帶到人類活動(dòng)較密集的農(nóng)耕區(qū)和居民區(qū)。恙蟲病是云南分布最廣的立克次體病,發(fā)病率一直居高不下,且時(shí)有暴發(fā)流行[14-17],本次研究結(jié)果是黃胸鼠和大絨鼠為恙蟲病東方體主要宿主,其攜帶的病原體有聚集現(xiàn)象,有引起暴發(fā)流行的可能。

埃立克體在自然界中以脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物為宿主,以節(jié)肢動(dòng)物硬蜱為傳播媒介。宿主動(dòng)物包括犬科動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、鹿、牛、羊等野生或家養(yǎng)動(dòng)物[18-19]。云南曾在硬蜱以及鼠類標(biāo)本中檢測(cè)到查菲埃立克體[20]。本次在嚙齒動(dòng)物中檢測(cè)到埃立克體,該株與分離自美國(guó)的伊文氏埃立克體(KJ942217)關(guān)系最近,與中國(guó)遼寧的埃立克體(EU179240)和巴西埃立克體(JQ260846)也處于同一分支。伊氏埃立克體主要侵襲犬粒細(xì)胞,由伊氏埃立克體引起的犬埃立克體病多發(fā)生于美洲鈍眼蜱密度高的美國(guó)中南部,引起的人埃立克體病癥狀與人單核細(xì)胞埃立克體病癥狀基本相同。

嚙齒動(dòng)物是無形體的主要儲(chǔ)存宿主。既往資料顯示,云南的嚙齒動(dòng)物和犬中存在無形體感染[21-22]。本次未在嚙齒動(dòng)物中檢測(cè)到無形體,但是從1份黃胸鼠樣本檢出沃爾巴克體,其在節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在。既往研究表明,沃爾巴克體主要存在于蚊蟲、白蟻、蠅等節(jié)肢動(dòng)物和昆蟲體內(nèi),約40%的節(jié)肢動(dòng)物和65%的昆蟲自然攜帶沃爾巴克體[23-24]。目前對(duì)于嚙齒動(dòng)物感染沃爾巴克氏體的研究很少,本研究是首次報(bào)道在鼠類中檢測(cè)到沃爾巴克體。

巴爾通體隸屬于根瘤菌目(Rhizobiales)下的巴爾通體科(Bartonellaceae)巴爾通體屬(Bartonella)。多種巴通體能夠感染人,如漢賽氏巴爾通體(Bartonellahenselae)引起貓抓病(Cat-scratch disease,CSD)、五日熱巴爾通體(Bartonellaquintana)引起戰(zhàn)壕熱(Trench fever)、桿狀巴爾通體引起卡里翁氏病、伊麗莎白巴爾通體(Bartonellaelizabethae)引起心內(nèi)膜炎等。本次用無形體16S r RNA基因PCR擴(kuò)出1個(gè)陽(yáng)性片段,經(jīng)測(cè)序分析后意外發(fā)現(xiàn)其屬于巴爾通體,與此前黎浩等和李伶俐等分別對(duì)恒河猴和小型獸進(jìn)行無形體PCR檢測(cè)時(shí),意外檢測(cè)到巴爾通體的結(jié)果一致[25-26]。

本研究證實(shí)瀘西地區(qū)為恙蟲病的自然疫源地,且少數(shù)嚙齒動(dòng)物還攜帶埃立克體、巴爾通體或沃爾巴克體,這些病原菌可能感染人,需注意防控。降低環(huán)境中鼠類、恙螨、蜱、蚤的密度是控制立克次體感染的重要措施,野外作業(yè)時(shí)做好個(gè)人防護(hù)也是預(yù)防立克次體感染的有效手段。

利益沖突:無

引用本文格式:袁慶虹,楊利圭,田杰,等.云南省瀘西縣嚙齒動(dòng)物攜帶立克次體調(diào)查[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2021,37(12):1141-1146.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.151