王瑞白,許 達,趙秀芹,萬康林

非結核分枝桿菌(Non-tuberculous mycobacteria,NTM)是除結核分枝桿菌復合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)和麻風分枝桿菌之外的所有分枝桿菌的總稱,包含有240余菌種。NTM在臨床癥狀、影像學特征及培養(yǎng)條件上和結核分枝桿菌很相似,但NTM的耐藥譜和結核分枝桿菌有很大差異,常規(guī)對一、二線抗結核藥物天然耐藥。因此,NTM感染以及其與結核的混合感染常表現為耐多藥結核感染,嚴重增加了治療的難度。因為人口學的變化、影像及檢測技術的提高,NTM感染所致“結核病”的發(fā)病率和疾病負擔在全球范圍內都有所上升。在美國等國家,NTM的流行甚至超過了結核分枝桿菌。NTM的感染以及與結核分枝桿菌的混合感染已成為結核病防控不可忽視的阻力。但與結核不同,國內外對NTM都沒有常規(guī)監(jiān)測,NTM的流行狀況基本都是通過系統(tǒng)性回顧研究及Meta分析獲得的,更勿論其與結核的混合感染。為了解我國NTM與結核混合感染的現狀及其對結核病防控的影響,我們對2020年以前的文獻進行了數據提取及分析。

1 材料與方法

1.1 檢索策略及文獻納入 使用“結核”和“非結核分枝桿菌/非典型分枝桿菌”以及《分枝桿菌菌種中文譯名原則專家共識》(2018)中的181個非結核分枝桿菌菌種名對4個外文數據庫(BIOSIS,Embase,Pub Med,Web of science)和3個中文文獻數據庫(知網,萬方,維普)進行題名/關鍵詞/摘要檢索。

納入標準:1)中國大陸地區(qū)的原始文獻;2)受檢樣本為疑似或確診結核病患者的痰液、血液、腦脊液等,或分枝桿菌培養(yǎng)陽性標本,有明確的臨床樣本量及分枝桿菌菌株總數;3)對樣本同時進行了MTBC和NTM的分離鑒定。

排除標準:1)直接針對疑似或已確診為NTM的樣本的研究;2)利用已知菌種的樣本進行的檢測方法的研究;3)個案報道;4)同一NTM菌種引起的暴發(fā)及院內感染;5)同一地區(qū)及時間段的重復性報道僅納入樣本量最大的一例;6)綜述及沒有全文的會議摘要等。

1.2 數據提取、管理及分析 從文獻中提取以下數據:樣本的采集時間及地點、病人及樣本類型、樣本數量、分離鑒定方法、菌株數量(結核、NYM、混合感染)、NTM中快生及慢生菌株數量、混合感染中的菌種組成、錯誤鑒定菌株數。使用軟件Stata 14(StataCorp,2015)和NoteExpress 3.0進行數據管理及Meta分析。異質性分析采用I2檢驗,森林圖用于發(fā)表偏倚的定量評估,Meta分析采用的是隨機模型。

2 結 果

2.1 文獻檢索結果 數據庫中檢索到1 725篇中文文獻及7篇英文文獻。題目及摘要篩選,去除1 369篇無關文獻。對剩余的356篇文獻進行全文篩選。最終納入193篇中文文獻及2篇英文文獻。納入文獻涉及27個省市自治區(qū),其中5個文獻數最多的省份為廣東(32篇)、江蘇(25篇)、浙江(24篇)、北京(20篇)和上海(14篇)。樣本最早采集時間為1988年,最長樣本收集年限為13年。79篇文獻檢測的是痰液等初始臨床樣本,116篇文獻直接檢測的分枝桿菌培養(yǎng)陽性樣本或分離到的分枝桿菌菌株。94.02%的文獻樣本收集年限大于1年,80.73%的文獻檢測的分枝桿菌數量大于100株(表1)。

表1 納入文獻的年限及樣本量分布Tab.1 Time period and sample size of included literatures

2.2 分枝桿菌菌株分離及菌種鑒定方法 納入文獻中108篇(54.87%)使用了對硝基苯酸(P-nitrobenzene acid,PNB)和噻吩-2-羧酸聯氨(thiophene-2-carboxylic acid hydrazine,TCH)鑒別培養(yǎng)基進行TB和NTM的區(qū)分。其中僅使用該方法的57篇,其余50篇結合了其他分子生物學的檢測方法,11篇使用了2種以上的鑒定方法。88篇文獻未使用PNB/TCH實驗,采用分子生物學檢測方法對樣本進行的菌種鑒定。其中58篇使用的單一方法,29篇結合了兩種以上的方法。DNA芯片和16Sr RNA等基因測序是使用頻率最高的NTM菌種分子生物學鑒定方法(見表2)。

表2 納入文獻中使用的分枝桿菌鑒定方法Tab.2 Identification methods used in the included literatures

2.3 NTM的分離 對疑似/確診結核病患者的初始樣本進行檢測的79篇文獻中,241 188個樣本中,共分離到84 639株分枝桿菌,其中NTM為9 203株。因此,在疑似/確診結核病患者中,分枝桿菌的粗分離率為35.4%,NTM的粗分離率為5.2%,在分枝桿菌中的占比為12.7%。在直接對培陽標本進行鑒定的116篇文獻中,273 504株分枝桿菌中鑒定到NTM 22 361株,NTM的占比為11.8%。兩種文獻類型間的NTM在分枝桿菌中的占比的差異無統(tǒng)計學意義,合并總效應值為12%(11.2%～12.7%)(表3)。

表3 中國大陸地區(qū)NTM及混合感染分離率及其在分枝桿菌中的占比(%)Tab.3 Isolation rates and proportions in Mycobacterium of NTM and mixed infection in mainland China(%)

納入文獻中97篇進行了NTM的菌種鑒定,其中77篇文獻中慢生型NTM多于快生型NTM。在分枝桿菌中,慢生型NTM占60.77%,為我國流行的優(yōu)勢型。

2.4 混合感染 195篇納入文獻中有26篇報道了NTM與結核的混合感染,其中16篇是對初始臨床樣本的分析,10篇是對培陽樣本的分析?；旌细腥驹谝伤?確診結核病人中的分離率為0.6%(0.2%～1.1%),在 分 枝 桿 菌 中 的 占 比 為1.4%(1.1%～1.8%)(表3,圖1)。在耐多藥結核的1例報道中,混合感染在分枝桿菌中的占比高達24.47%[1]。HIV/AIDS合并分枝桿菌感染的2例報道中,混合感染在分枝桿菌中的占比分別為2.68%和1.03%[2-3]。

圖1 混合感染meta分析森林圖Fig.1 Meta-analysis of mixed infection of NTM and TB

11篇文獻中進行了NTM的菌種鑒定。與TB的混合感染中胞內分枝桿菌例數最多,25例,占混合感染的26.9%。其余7種菌種分別為龜分枝桿菌(17例)、膿腫分枝桿菌(15例)、戈登分枝桿菌(11例)、偶發(fā)分枝桿菌(10例)、堪薩斯分枝桿菌(10例)、鳥分枝桿菌(4例)、蟾蜍分枝桿菌(1例)?？焐头种U菌共42例,慢生型51例。

僅1篇文獻對NTM/TB混合感染的人群特征進行了比較分析。其中80例單一NTM感染者的年齡主要集中在20～30歲和40～60歲兩組,而11例NTM/TB混合感染者在30～50歲組最多,男性感染者尤其集中于40～50歲[4]。

3 討 論

我國NTM的流行呈現明顯的波動式,20年的系統(tǒng)性回顧分析顯示大陸地區(qū)NTM在結核疑似病例中的粗分離率為4.66%～5.78%,在分枝桿菌中的占比為11.57%[5],本次分析結果與此一致。NTM在疑似結核病患者樣本中分離率不足10%,而且NTM是條件致病菌,在樣本中檢出NTM時分為污染、定殖和致病3種情況,NTM感染的確診,需要對痰液等樣本重復取樣復檢2～3次。因此,最經濟高效的檢測流程是先初篩,確定是否是分枝桿菌感染,是結核還是NTM,或兩者的混合感染。在確定樣品中存在NTM后,再進一步進行菌種鑒定。分離到菌株后,可以進行分枝桿菌菌種鑒定的方法有不下十余種,包括16S rDNA測序、特異性PCR擴增等,雖然不同方法的靈敏度和特異度不同,但這一步已不是整個流程中的瓶頸問題。因此如何確定樣本中TB和NTM的存在情況是鑒定的難點。目前,我國結核病臨床檢驗參考的依據主要包括《全國結核病細菌學檢驗規(guī)程》(1984版)、《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》(中國防癆協會,1995版)及《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》(2015版),依照的也是如上的鑒定思路,即在BACTEC MGIT 960或改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性后,用PNB/TCH鑒別培養(yǎng)基區(qū)分為人型結核分枝桿菌、牛型結核分枝桿菌與NTM三類,其中人型結核PNB(－)TCH(＋),牛型結核PNB(－)TCH(－),NTM PNB(＋)TCH(＋)。之后再利用生化、16S r DNA基因測序等方法將NTM鑒定到種。該流程成本低廉,對操作要求不高,適用于基層實驗室,可以解決大部分分枝桿菌的鑒定需求,在我國結核病防控工作中發(fā)揮了重要的作用。但其中的PNB/TCH存在3個主要缺陷:1)基于分枝桿菌生長的實驗方法,加上之前960或羅氏培養(yǎng),需要6－8周,非常耗時;2)兩類分枝桿菌對PNB的敏感性不是絕對的,存在對PNB敏感的NTM菌株,也存在耐受PNB的MTBC菌株。PNB實驗的錯判率為10%～20%[6-7];3)不適用于混合感染,NTM在PNB/TCH上都能生長,會遮蓋MTBC的結果,故而僅使用該方法的既往研究基本都是僅包含MTBC和NTM,沒有混合感染的數據,這也是本次分析中195篇納入文獻中僅26篇含混合感染,1篇文獻進行了人群特征分析的主要原因。而對NTM及其與結核的混合感染關注度不足,不了解實驗方法的缺陷應該是其中存在的主觀因素。

部分研究中用多位點基因擴增、斑點雜交、基因芯片等方法取代PNB/TCH實驗,用于痰液等初始臨床及培陽標本的檢測,以縮短檢測時間,提高檢測的靈敏度和特異度。但其中僅一部分方法適用于混合型樣本。如細菌鑒定中最常用,也常被視為“金標”的16S r DNA基因測序,顯示的是標本中數量優(yōu)勢或擴增優(yōu)勢的菌種的結果,菌量少的菌種不能顯示,而菌量近似時,測序會出現雙峰。針對細菌保守基因的PCR擴增及檢測,除非是菌種特異性引物,通用型引物都存在類似的問題?；蛐酒?、斑點雜交等是有混合感染檢測能力的方法,單個使用或多個方法的聯用,雖然可以實現樣本的精準鑒定,但檢測成本比較高,有一定的技術能力及儀器要求,不適用于基層實驗室的常規(guī)檢測及大規(guī)模樣本分析。而且其商品化的試劑盒,鑒定范圍多限于臨床常見的20余種NTM菌種,文獻中常見分離的NTM菌株超出試劑盒檢測范圍的情況,存在一定的漏診率。因此不在于檢測技術的新穎性,更適用于基層的分枝桿菌快診新靶標的研發(fā)和推廣使用是實現結核病精準診療,從而降低患者的診療負擔,提高結核病終止計劃實施效率的關鍵。

利益沖突:無

引用本文格式:王瑞白,許 達,趙秀芹,等.我國結核與非結核分枝桿菌混合感染的系統(tǒng)性回顧及Meta分析[J].中國人獸共患病學報,2021,37(12):1147-1151.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.161