趙瑞翔, 趙芯晨, 陸佳, 陳賢格, 毛學

1杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院全科醫(yī)學科(浙江杭州 311400)； 2首都醫(yī)科大學附屬宣武醫(yī)院重癥醫(yī)學科(北京 100032)； 3嘉善縣第一人民醫(yī)院心血管內科(浙江嘉興 314100)； 4平陽縣婦幼保健院內科(浙江溫州 325401)

糖尿病心肌病能夠引起微小但持續(xù)的心臟損傷，最終可發(fā)展為心力衰竭[1]。前人研究發(fā)現(xiàn)，高糖可促進心肌細胞自噬，激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)通路能夠抑制自噬，緩解高糖誘導的心肌細胞損傷[2]。另外，microRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內源性的具有基因調控功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸，其中miR-1在糖尿病患者心臟中表達異常[3]。在小鼠缺血性心肌損傷中，miR-1表達上調，可抑制PI3K靶基因的表達，推測抑制miR-1可能是治療小鼠缺血性心律失常的機制[4]。另外，上調miR-1表達可促使心肌細胞凋亡，并引起心肌細胞損傷[5]。miR-1還可能通過抑制PI3K/Akt信號通路，促進急性心肌梗死患者的不良心室重構[6]。研究顯示，PI3K參與多種細胞功能，可與信號蛋白蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)結合，磷酸化AKT的Ser308致使AKT活化，AKT通過下游多種途徑對靶蛋白進行磷酸化而發(fā)揮作用，其中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)為其下游靶蛋白之一，且PI3K/Akt/mTOR信號通路與自噬密切相關[7]。但是，目前miR-1調控PI3K/AKT/mTOR通路對高糖高糖誘導的H9c2心肌細胞自噬的影響鮮見報道。因此，本研究2019年1月至2020年8月，使用33 mmol/L高濃度葡萄糖誘導H9c2心肌細胞同時抑制miR-1表達，觀察其對細胞增殖、自噬及PI3K/AKT/mTOR通路的影響，初步探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細胞H9c2(目錄號：GNR5)購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。主要試劑及儀器：含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基購自美國Giboc公司；RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自美國Genecopoeia公司；雙螢光素酶檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；qRT-PCR檢測試劑盒購自上海生工生物科技有限公司；細胞計數(shù)試劑盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購自濟南遠達晶美生物科技有限公司；野生型和突變型PI3K 3′ UTR螢光素酶報告基因載體(PI3K WT、PI3K MUT)、miR-1 NC(miR-27a陰性對照)、miR-1模擬物(miR-1 mimics)、miR-1抑制物(miR-1 inhibitor)以及miR-1、U6引物均由上海生工生物工程有限公司合成；Lipofectamine 3000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；葡萄糖、PVDF膜、β-actin鼠抗均購自美國Sigma公司；ECL顯色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自北京中山金橋生物科技有限公司；PI3K兔單克隆抗體、Beclin1兔單克隆抗體、LC3兔單克隆抗體、p-AKT兔多克隆抗體、AKT兔多克隆抗體、p-mTOR兔單克隆抗體、mTOR兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗均購自美國Abcam公司；酶標儀Fax-20100購自美國INStat公司；TL988 qRT-PCR儀購自西安天隆科技有限公司；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDoc-MP購自山東三瑞科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 大鼠心肌細胞H9c2使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長密度達80%～90%左右時，進行傳代培養(yǎng)。

將H9c2細胞隨機分為4組：正常組使用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，未轉染；誘導組使用含33 mmol/L葡萄糖[8]的培養(yǎng)基培養(yǎng)；miR-1 NC組細胞轉染miR-1 NC后，使用含33 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)；miR-1 inhibitor組細胞轉染miR-1 inhibitor后，使用含33 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)。在加入葡萄糖誘導前48 h，使用Lipofectamine 3000轉染試劑盒分別轉染細胞miR-1 NC或miR-1 inhibitor。

1.2.2 qRT-PCR檢測正常H9c2細胞和高糖誘導的H9c2細胞中miR-1表達水平 葡萄糖誘導24 h后，采用RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒得到cDNA，以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒詳細說明書配置PCR反應體系并設定反應程序。以U6作為內參，根據(jù)2-ΔΔCt算法，計算miR-1表達水平。miR-1和U6引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 生物信息學預測和雙螢光素酶驗證miR-1和PI3K的靶向關系 采用Genecard數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)對miR-1和PI3K的結合位點進行預測。取對數(shù)生長期的H9c2細胞接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將細胞分為miR-1 mimics+PI3K WT組、miR-1 NC+PI3K WT組、miR-1 mimics+PI3K MUT組和miR-1 NC+PI3K MUT組，每組設6個復孔，使用Lipofectamine 3000轉染試劑盒進行細胞共轉染。轉染48 h后，使用雙螢光素酶檢測試劑盒檢測螢光素酶活性，具體操作按照試劑盒說明書進行，驗證miR-1和PI3K的靶向關系。

1.2.4 CCK-8法檢測各組H9c2細胞增殖活性 收集各組細胞，每孔各取100 μL接種至96孔板中，按照CCK-8檢測試劑盒說明書，加入濃度為10%的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，使用Fax-20100酶標儀測定各孔在450 nm波長下的OD值。依據(jù)公式：細胞增殖率(%)=(實驗組OD450nm-空白組OD450nm)/(對照組OD450nm-空白組OD450nm)，計算各組H9c2細胞的增殖率。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀察各組H9c2細胞自噬形態(tài) 收集各組細胞，加入2.5%戊二醛溶液4℃過夜固定，磷酸鹽緩沖液清洗，1%鋨酸溶液4℃固定2 h后，低濃度到高濃度丙酮溶液梯度脫水，依次進行滲透、包埋、聚合、切片和染色等步驟后，于透射電子顯微鏡下觀察各組細胞自噬形態(tài)。

1.2.6 共聚焦顯微鏡觀察各組H9c2細胞自噬流 將各組H9c2細胞置于35 mm共聚焦皿中培養(yǎng)，當生長密度達60%～80%時，將mRFP-GFP-LC3雙熒光標記自噬腺病毒滴加如培養(yǎng)皿中，然后置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，更換培養(yǎng)基后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，置于共聚焦顯微鏡中觀察自噬流變化。其中綠色熒光(GFP)和紅色熒光(RFP)相融合后形成的黃色熒光(Merge)即為自噬小體。

1.2.7 Western blot法檢測各組H9c2細胞中自噬相關蛋白及通路蛋白表達水平 收集各組細胞，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，然后依次進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、轉PVDF膜、脫脂奶粉封閉、1∶2 000濃度稀釋后的Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p65、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、β-actin一抗4 ℃過夜孵育、含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5 000)中室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，以β-actin內參，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白表達水平。

2 結果

2.1 正常心肌細胞和高糖誘導的心肌細胞中miR-1和PI3K蛋白表達水平比較 與正常組相比，誘導組細胞中miR-1表達水平顯著升高(P<0.05)，PI3K蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1 對照組和誘導組中PI3K蛋白表達(Western blot)

表2 細胞中miR-1和PI3K蛋白表達水平比較

2.2 抑制miR-1對高糖誘導的心肌細胞H9c2增殖活性的影響 與正常組相比，誘導組H9c2細胞miR-1水平顯著升高，細胞增殖率顯著降低(P<0.05)；與誘導組和miR-1 NC組相比，miR-1 inhibitor組H9c2細胞miR-1水平顯著降低，細胞增殖率顯著升高(P<0.05)。見表3。

2.3 抑制miR-1對高糖誘導的心肌細胞H9c2自噬的影響 正常組H9c2細胞未見明顯自噬小體形成，與正常組相比，誘導組H9c2細胞自噬小體增多；與誘導組和miR-1 NC組相比，miR-1 inhibitor組H9c2細胞自噬小體減少。見圖2～3。

注：箭頭代表自噬小體；A:正常組；B:誘導組；C:miR-1 NC組；D:miR-1 inhibitor組

圖3 各組H9c2細胞自噬小體熒光圖

2.4 抑制miR-1對高糖誘導的心肌細胞H9c2自噬相關蛋白的影響 與正常組相比，誘導組H9c2細胞Beclin1表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高，p62蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與誘導組和miR-1 NC組相比，miR-1 inhibitor組H9c2細胞Beclin1表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低，p62蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖4和表4。

注：A:正常組；B:誘導組；C:miR-1 NC組；D:miR-1 inhibitor組

表4 各組細胞中Beclin1和P62蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比較

2.5 下調miR-1對高糖誘導的心肌細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達的影響 與正常組相比，誘導組H9c2細胞PI3K蛋白表達及Akt、mTOR蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.05)；與誘導組和miR-1 NC組相比，miR-1 inhibitor組H9c2細胞PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平升高(P<0.05)。見圖5和表5。

注：A：正常組；B：誘導組；C：miR-1 NC組；D：miR-1 inhibitor組

表5 各組細胞中PI3K蛋白表達及Akt和mTOR蛋白磷酸化水平比較

2.6 miR-1和PI3K基因靶向關系的預測與驗證 生物信息學預測結果顯示，miR-1序列上存在與PI3K3′UTR結合的連續(xù)位點。我們運用雙螢光素酶實驗對其進行驗證，發(fā)現(xiàn)共轉染miR-1 mimics和PI3K WT報告載體時，細胞螢光素酶活性受到明顯抑制(P<0.05)；而共轉染miR-1 mimics和PI3K-MUT報告載體及轉染miR-1 NC和PI3K WT或PI3K MUT報告載體的細胞，螢光素酶活性無抑制作用(P>0.05)。見圖6～7。

注：WT：wild-type，野生型；MUT：mutant-type，突變型；UTR：untranslated region，非翻譯區(qū)

注：WT：wild-type，野生型；MUT：mutant-type，突變型；*與miR-1 NC+PI3K WT組比較P<0.05

3 討論

糖尿病心肌病是糖尿病患者在排除冠心病、高血壓和冠狀動脈粥硬化等疾病后，產生的心肌代謝紊亂，心肌間質增生和微血管病變等特異性疾病[9]。

另外，Delfan等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-1在糖尿病患者心臟中表達水平顯著升高，而高強度間歇訓練能夠抑制miR-1表達，進而降低糖尿病性心肌病的發(fā)生率。本研究以大鼠心肌細胞H9c2細胞為研究對象，使用33 mmol/L葡萄糖誘導心肌細胞H9c2后發(fā)現(xiàn)，高糖誘導可使H9c2細胞中miR-1表達水平顯著升高，且顯著降低細胞增殖率，提示高糖引起的miR-1異常表達可抑制心肌細胞增殖。

miR-1基因沉默對高糖誘導的心肌細胞損傷具有抑制作用，其機制可能與細胞自噬有關[11]。肝孤核受體激動劑可緩解高糖誘導的H9c2細胞損傷，而miR-1過表達卻消除了肝孤核受體激動劑發(fā)揮的緩解作用[12]，并且miR-1已被證實是治療糖尿病心肌病的主要靶點[13]。另外，自噬蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達水平可反映自噬程度，自噬溶酶體降解底物p62表達的增加與自噬水平呈負相關[14]。而高糖環(huán)境可引起視網(wǎng)膜血管內皮細胞自噬[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導的心肌細胞H9c2中，Beclin1蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高自噬小體增多，p62蛋白表達水平顯著降低，提示高糖誘導的H9c2心肌細胞自噬活性增強，但其中的機制尚需進一步研究。

PI3K/Akt/mTOR信號通路與高糖誘導的心肌細胞自噬密切相關[16]，抑制PI3K/Akt信號通路，降低p-Akt水平，可促使大鼠肝星狀細胞自噬的發(fā)生，引起細胞損傷[17]；激活PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路，可通過抑制自噬，明顯改善缺氧預處理對高糖心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用[18]。本研究結果顯示，高糖誘導的心肌細胞H9c2中，PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平顯著降低，提示，高糖誘導下H9c2心肌細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路處于抑制狀態(tài)。Chen等[19]研究發(fā)現(xiàn)胰島素能夠通過Akt的激活改善氧化應激下miR-1誘導的H9c2細胞損傷。而Wu等[20]研究發(fā)現(xiàn)增加miR-1的表達，可抑制心肌損傷細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路。為進一步探究miR-1和PI3K間的靶向關系，本研究使用生物信息學預測和雙螢光素酶驗證發(fā)現(xiàn)，miR-1和PI3K間存在靶向關系。本研究進一步通過將miR-1 inhibitor轉染至H9c2細胞后，使用高糖誘導，發(fā)現(xiàn)抑制miR-1可顯著降低高糖下H9c2細胞中miR-1水平、Beclin1蛋白表達水平以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，減少自噬小體，顯著提高細胞增殖率、p62蛋白表達水平以及PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平，提示抑制miR-1表達，可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制H9c2細胞自噬。

綜上所述，高糖誘導可使心肌細胞中miR-1表達水平升高，而抑制miR-1表達，可能通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，進而抑制H9c2細胞自噬。但是高糖誘導的心肌細胞中的作用機制較為復雜，尚需深入研究。