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        LncRNA TUG1靶向miR-222-3p對肺炎鏈球菌誘導的人肺泡上皮細胞損傷的影響

        2022-01-05 01:13:38李小麗張慶軍
        國際檢驗醫(yī)學雜志 2021年24期
        關鍵詞:共轉染鏈球菌熒光素酶

        李小麗,王 輝,張慶軍

        應急總醫(yī)院呼吸內科,北京 100028

        肺炎在全球發(fā)病率非常高,患者康復時間長且病死率高[1]。肺炎鏈球菌是一種機會性病原體,定植在人類上呼吸道的黏膜表面,通過局部擴散、吸入或播種等方式到達血液中,引起肺炎等疾病[2-4]。因此,了解肺炎鏈球菌感染過程涉及的分子途徑對于預防和治療肺炎至關重要。越來越多的研究顯示,長鏈非編碼RNA(LncRNA)是多種人類疾病診斷的潛在生物標志物[5-6]。LncRNA?;撬嵘险{基因1(TUG1)通過抑制微小RNA(miRNA)-127,保護脂多糖(LPS)誘發(fā)的MRC-5細胞損傷,在肺炎中顯示出較好的治療效果[6]。TUG1通過海綿miR-590-5p/FGF1促進哮喘患者氣道平滑肌細胞的增殖和遷移,并減少了細胞凋亡[7]。miR-222-3p在肺炎支原體肺炎患兒中高表達,可能是診斷肺炎支原體肺炎和判斷患者預后的生物標志物[8]。但TUG1對肺炎鏈球菌感染的人肺泡上皮細胞(HPAEpiC細胞)凋亡的影響,以及miR-222-3p是否介導其作用過程,目前尚未明確。因此,本研究以肺炎鏈球菌感染HPAEpiC細胞構建肺損傷模型,并評估TUG1在該模型中的影響,除此之外,還探討了TUG1和miR-222-3p之間的調控關系,同時評估m(xù)iR-222-3p在TUG1影響細胞損傷中的作用,揭示TUG1的潛在作用機制,為治療肺炎提供新的依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1儀器與試劑 72株HPAEpiC細胞(美國ScienCell),肺炎鏈球菌-3型(美國菌種保藏中心),Lipofectamine 2000、TUG1小干擾RNA(Si-TUG1)、陰性對照siRNA(Si-NC,美國Invitrogen),miR-222-3p、miR-NC、anti-miR-222-3p、anti-miR-NC(上海吉瑪),PrimeScript RT試劑盒、SYBR Green Premix Ex Taq(大連Takara),miRcute miRNA qPCR檢測試劑盒(北京Tiangen),膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC/PI試劑盒(上海Beyotime),牛血清蛋白、總蛋白提取試劑盒(上海Solarbio),硝酸纖維素膜(美國Millipore),PGL3報告基因載體、雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(美國Promega)。

        1.2方法

        1.2.1細胞培養(yǎng)與肺炎鏈球菌感染 HPAEpiC細胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)/F12中于37 ℃、5% CO2的濕潤環(huán)境下培養(yǎng)。肺炎鏈球菌在含脫纖維羊血(5%)的血平板中培養(yǎng)。感染時,采用1×108CFU/mL肺炎鏈球菌(提前12 h在含0.5%酵母的托休二氏溶液中培養(yǎng))感染HPAEpiC細胞48 h[9]。

        1.2.2細胞分組與處理 HPAEpiC細胞分為對照(NC)組、肺炎鏈球菌組、肺炎鏈球菌+Si-NC組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1組、肺炎鏈球菌+miR-NC組、肺炎鏈球菌+miR-222-3p組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-NC組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-222-3p組。NC組HPAEpiC細胞未做任何處理;肺炎鏈球菌組HPAEpiC細胞以1×108CFU/mL肺炎鏈球菌感染;肺炎鏈球菌+Si-NC組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1組、肺炎鏈球菌+miR-NC組、肺炎鏈球菌+miR-222-3p組的HPAEpiC細胞分別轉染Si-NC、Si-TUG1、miR-NC、miR-222-3p,肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-NC組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-222-3p組共轉染Si-TUG1+anti-miR-NC、Si-TUG1+anti-miR-222-3p,轉染后24 h,以1×108CFU/mL肺炎鏈球菌感染。HPAEpiC細胞轉染時,按照制造商的操作規(guī)程,將HPAEpiC細胞在六孔板上預孵育至40%~60%匯合,然后與寡核苷酸或siRNA及Lipofectamine 2000一起孵育進行轉染。

        1.2.3實時定量PCR檢測TUG1、miR-222-3p表達 根據(jù)制造商的規(guī)程,通過TRIzol試劑從HPAEpiC細胞中提取總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒進行cDNA合成。使用SYBR Green Premix Ex Taq和miRcute miRNA qPCR檢測試劑盒在ABI 7500系統(tǒng)上進行實時定量PCR檢測。GAPDH和U6充當內源性對照。引物序列為TUG1正向5′-GGACACAATTCGCCACGACTT-3′,反向5′-GCGCAGTCCCAGATTCCA-3′;GAPDH正向5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,反向5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。miR-222-3p正向5′-AGCTACATCTGGCTACTGG-3′,反向5′-GTATCCAGTGCAGGGTCC-3′;U6正向5′-CTC GCTTCGGCAGCACA-3′,反向5′-TGGTGTCGT GGAGTCG-3′。

        1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 借助Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測HPAEpiC細胞凋亡(1×105個細胞/孔)。將500 μL結合緩沖液與HPAEpiC細胞懸液混合。然后,添加5 μL Annexin V-FITC并保持5 min,隨后添加5 μL PI并在黑暗中于室溫下反應10 min。使用Beckman Coulter流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

        1.2.5Western blotting檢測蛋白表達 使用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白,并使用二辛可寧酸方法對HPAEpiC細胞蛋白進行定量。制備分離凝膠(10%)和濃縮凝膠(5%),每個孔中加入20 μL蛋白樣品,進行SDS-PAGE,電泳結束,在3 mA下2 h完成硝酸纖維素膜的轉移。室溫下用5%牛血清清蛋白封閉膜2 h。將一抗Bcl2相關X蛋白(Bax蛋白,1∶3 000稀釋)和B細胞淋巴瘤/白血病2(Bcl2蛋白,1∶3 000稀釋)與膜在4 ℃條件下孵育過夜,然后,將其與HRP標記二抗(1∶5 000稀釋)在室溫下混合2 h,采用增強化學發(fā)光法(ECL)化學發(fā)光保持30 min后,再采用Image-Pro Plus軟件進行蛋白水平分析。

        1.2.6雙熒光素酶報告實驗 含有miR-222-3p結合位點的野生型(WT)-TUG1/突變型(MUT)-TUG1序列被擴增并克隆到PGL3報告基因載體中。將HPAEpiC細胞接種到六孔板中后培養(yǎng)過夜,并與WT-TUG1/MUT-TUG1報告基因質粒和miR-222-3p/miR-NC共轉染。轉染后48 h,螢火蟲和海腎熒光素酶活性使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測量。針對海腎熒光素酶基因的活性對數(shù)據(jù)進行標準化。

        2 結 果

        2.1肺炎鏈球菌感染對HPAEpiC細胞中miR-222-3p和TUG1表達的影響 肺炎鏈球菌感染前后,肺炎鏈球菌組HPAEpiC細胞中TUG1表達量為(0.43±0.03),約為NC組(1.03±0.02)的0.42倍,肺炎鏈球菌組miR-222-3p表達量為(2.30±0.09),約為NC組(1.01±0.03)的2.28倍,差異均有統(tǒng)計學意義(t=18.790,P<0.001;t=13.860,P<0.001)。

        2.2轉染TUG1對肺炎鏈球菌誘導的HPAEpiC細胞凋亡的影響 肺炎鏈球菌組和肺炎鏈球菌+Si-NC組HPAEpiC細胞的TUG1表達量均低于NC組,凋亡率、Bax蛋白表達量均高于NC組,Bcl2蛋白表達量低于NC組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。肺炎鏈球菌+Si-TUG1組HPAEpiC細胞的TUG1表達量低于肺炎鏈球菌+Si-NC組,凋亡率、Bax蛋白表達量均高于肺炎鏈球菌+Si-NC組,Bcl2蛋白表達量低于肺炎鏈球菌+Si-NC組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

        表1 轉染TUG1對肺炎鏈球菌誘導的HPAEpiC細胞凋亡的影響

        注:A為蛋白質電泳圖;B、C、D、E均為流式凋亡圖。

        2.3TUG1靶向調控miR-222-3p的表達 miR-222-3p與TUG1含有靶向結合的核苷酸序列,生物信息學預測結果見圖2。miR-222-3p與WT-TUG1共轉染的熒光素酶活性(0.46±0.03)是miR-NC與WT-TUG1共轉染的熒光素酶活性(1.00±0.01)的0.46倍,差異有統(tǒng)計學意義(t=18.960,P<0.001);而miR-222-3p、MUT-TUG1共轉染的熒光素酶活性(1.00±0.02)與miR-NC、MUT-TUG1共轉染的熒光素酶活性(1.02±0.03)比較,差異無統(tǒng)計學意義(t=0.429,P=0.674)。

        圖2 miR-222-3p含有與TUG1靶向結合的位點

        2.4過表達miR-222-3p對肺炎鏈球菌誘導的HPAEpiC細胞凋亡的影響 肺炎鏈球菌+miR-222-3p組HPAEpiC細胞的miR-222-3p表達量、凋亡率、Bax蛋白表達量比肺炎鏈球菌+miR-NC組高,且Bcl2蛋白表達量比肺炎鏈球菌+miR-NC組低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3、表2。

        表2 肺炎鏈球菌+miR-NC組和肺炎鏈球菌+miR-222-3p組的miR-222-3p、凋亡率、凋亡蛋白比較

        2.5干擾miR-222-3p表達部分逆轉TUG1對肺炎鏈球菌誘導的HPAEpiC細胞凋亡的影響 與肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-NC組比較,肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-222-3p組HPAEpiC細胞中miR-222-3p表達量、凋亡率和Bax蛋白表達量降低,Bcl2蛋白表達量升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4、表3。

        注:A為蛋白質電泳圖;B、C均為流式凋亡圖。

        注:A為蛋白質電泳圖;B、C均為流式凋亡圖。

        表3 肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-NC組與肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-222-3p組的miR-222-3p、凋亡率、凋亡蛋白比較

        3 討 論

        本研究探討了TUG1對肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細胞的影響,結果發(fā)現(xiàn),肺炎鏈球菌觸發(fā)了HPAEpiC細胞凋亡。此外,干擾TUG1加速了肺炎鏈球菌誘發(fā)的HPAEpiC細胞凋亡。另外,干擾miR-222-3p表達部分逆轉干擾TUG1對肺炎鏈球菌誘導的HPAEpiC細胞凋亡的影響。

        TUG1已被廣泛應用于各種癌癥研究中,包括腎細胞癌[10]、前列腺癌[11]、胃癌[12]、結腸癌[13]。越來越多的證據(jù)證實TUG1在多種癌癥病理、生理過程中均發(fā)揮了特定的生物學功能。例如,一項研究表明,過表達的TUG1通過減弱細胞凋亡和炎性反應來保護小鼠免受寒冷誘導的肝損傷[14]。此外,研究表明,在LPS引起的MRC-5細胞損傷中,TUG1減輕了細胞凋亡,下調Bax蛋白表達而上調Bcl2蛋白表達,機制與調控miR-127有關[6]。在哮喘大鼠模型中,沉默TUG1可增加哮喘中氣道平滑肌細胞的凋亡,而TUG1過表達抑制細胞凋亡[7]。然而,目前研究尚未揭示TUG1是否能保護HPAEpiC細胞免受肺炎鏈球菌觸發(fā)的細胞損傷。本研究觀察到,TUG1在肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細胞中低表達,干擾TUG1能明顯促進肺炎鏈球菌誘導的HPAEpiC細胞凋亡。同時,干擾TUG1可誘導促凋亡蛋白Bax蛋白的表達并抑制抗凋亡蛋白Bcl2蛋白的表達。這些數(shù)據(jù)均提示,TUG1對HPAEpiC細胞中肺炎鏈球菌觸發(fā)的細胞凋亡具有抑制作用。

        miRNA通過控制參與組織發(fā)育和再生的多個信號和轉錄因子的表達,已成為病理過程的關鍵調節(jié)劑[15]。根據(jù)報道,在胃癌[16]、腎細胞癌[17]、非小細胞肺癌[18]和宮頸癌[19]患者中,miR-222-3p表達增加。然而,在卵巢癌[20]及嚴重心肌纖維化患者中觀察到較低的miR-222-3p水平[21]??梢娫诓煌膊』颊咧?,miR-222-3p表達不同。研究顯示,與正常椎間盤組織比較,椎間盤退變組織中的miR-222-3p明顯增加;miR-222-3p過表達明顯增加了髓核細胞的凋亡并減少其增殖,miR-222-3p的下調可抑制髓核細胞凋亡并誘導增殖;miR-222-3p會加速椎間盤退變的發(fā)展[22]。本研究發(fā)現(xiàn),肺炎鏈球菌感染使HPAEpiC細胞miR-222-3p表達上調,與以往研究報道一致[8]。更重要的是,miR-222-3p過表達可以增加肺炎鏈球菌誘導的HPAEpiC細胞凋亡,同時上調促凋亡蛋白Bax蛋白,下調抗凋亡蛋白Bcl2蛋白。上述數(shù)據(jù)與以往的研究部分相似[22],提示miR-222-3p可能加重肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細胞損傷。

        本研究的生物信息學預測表明,TUG1序列中存在假定的miR-222-3p結合位點。雙熒光素酶報告實驗結果揭示了miR-222-3p為TUG1的靶標,TUG1可以靶向調控miR-222-3p的表達。但miR-222-3p是否影響TUG1對肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細胞損傷的保護活性仍然未知。本研究進一步觀察到,干擾miR-222-3p表達后,干擾TUG1促進肺炎鏈球菌誘導的HPAEpiC細胞凋亡的作用被部分逆轉。表明TUG1通過靶向調控肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細胞中miR-222-3p的表達,減輕細胞凋亡。

        綜上所述,TUG1通過靶向miR-222-3p對肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細胞起保護活性。這些發(fā)現(xiàn)可能為肺炎鏈球菌感染的肺炎提供一種新的治療方法。

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