楊利俊，張 謙

內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科，內蒙古呼和浩特 010050

支原體肺炎為兒童常見社區(qū)獲得性肺炎，占全部兒童肺炎的20%左右[1]。支原體肺炎具有發(fā)病隱匿、易復發(fā)、病情遷延不愈等特點。輕癥患兒多僅有發(fā)熱和咳嗽癥狀，無呼吸困難表現，而重癥患兒可合并胸腔積液，甚至包括呼吸系統在內的多系統功能障礙等，嚴重影響患兒生活質量，甚至危及生命[2]。有研究表明，異常免疫反應及其介導的炎性反應可能是支原體肺炎的重要發(fā)病機制[3]。微小核糖核酸(miRNA)為一類長度約為22 nt的非編碼單鏈RNA分子。近年研究發(fā)現，miRNA具有調節(jié)免疫反應和炎性反應的作用[4]。CHU等[5]研究發(fā)現，支原體肺炎患兒外周血miR-222-3p水平明顯升高，尤其在合并胸腔積液患兒中高表達。有研究指出，miR-155參與調控免疫應答、炎性反應等多種細胞功能，且可通過靶向調控多種細胞因子表達，參與肺炎等肺部疾病發(fā)生和發(fā)展[6]。故miR-222和miR-155在支原體肺炎中的表達及其與疾病發(fā)生、發(fā)展的關系值得進一步探討。因此，本研究通過檢測支原體肺炎患兒血清miR-222和miR-155水平，探討二者與病情嚴重程度、潮氣呼吸肺功能的關系，旨在為支原體肺炎的臨床診斷及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年1月至2020年12月本院收治的188例支原體肺炎患兒為研究對象。納入標準：(1)3～16歲；(2)符合支原體肺炎診斷標準[7]；(3)可配合進行潮氣呼吸肺功能檢測；(4)患兒及其法定監(jiān)護人對本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并細菌、病毒、肺炎衣原體等感染；(2)既往有呼吸系統疾病史；(3)合并慢性基礎疾病，嚴重肝、腎等臟器功能不全，自身免疫性疾病，哮喘；(4)近1個月內接受過抗感染治療。根據病情嚴重程度將188例患兒分為輕癥組和重癥組[7]，輕癥組96例，男44例，女52例；年齡3～15歲，平均(6.34±2.12)歲；重癥組92例，男41例，女51例；年齡4～14歲，平均(6.28±2.23)歲。選擇同期本院體檢健康兒童作為健康對照組，無呼吸系統感染、自身免疫性疾病及相關病史，且近1個月內未接受過抗感染治療。健康對照組共84例兒童，男37例，女47例；年齡3～15歲，平均(6.37±2.25)歲。3組兒童性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準后進行。

1.2血清miR-222和miR-155水平檢測 (1)采集所有研究對象空腹外周靜脈血2 mL，分離血清，加入TRIzol試劑(北京百奧萊博科技有限公司，貨號GL1311)提取總RNA，測定RNA純度和水平。(2)反轉錄合成cDNA，試劑盒購自德國Qiagen公司(貨號205111)。(3)由上海生工生物工程股份有限公司設計引物序列。miR-222上游引物：5′-GCGAGCTACATATGTGGA-3′，下游引物：5′-CATGGCGTGTAGTGGAGT-3′。miR-155上游引物：5′-GGGACGTGGTTTAAGTGC-3′，下游引物：5′-CCGTTTGCAACTGTGTAT-3′。U6為內參，上游引物：5′-ATTGGACAGTATGACAAA-3′。(4)引物合成后，PCR儀(美國賽默飛世爾公司，型號ProFlex)進行反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)。反應體系：SYBRTMGreen PCR Master Mix(美國賽默飛世爾公司，貨號4309155)10.0 μL，cDNA 1.0 μL，上游和下游引物各0.5 μL，ddH2O 8.0 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，1次，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，1次。(5)繪制標準曲線，計算循環(huán)閾值(Ct)，Ct=—1/lg(1+Ex)×lgX0+lgN/lg(1+Ex)，其中Ex為擴增效率，X0為初始模板量，N為熒光擴增信號到達閾值強度時擴增產物量，采用2—ΔΔCt法進行定量分析。

1.3潮氣呼吸肺功能檢測 檢查當日清理鼻腔分泌物，保持上呼吸道通暢；操作盡量避免進餐期間，可于進食后30 min至2 h進行；測量兒童體質量，精確至0.5 kg；檢查前，幼兒及配合度較差兒童根據體質量給予10%水合氯醛，劑量為0.5 mL/kg，口服或保留灌腸，配合度較好兒童囑靜坐；選擇適宜大小面罩，緊扣口鼻，保證無漏氣；調節(jié)肺功能儀(德國耶格醫(yī)療器械有限公司，型號MasterScreen PFT System)參數，待呼吸平穩(wěn)后，連續(xù)記錄5次，每次記錄100個潮氣呼吸流量-容積環(huán)，取平均值作為最終結果。

1.4觀察指標 分析各組血清miR-222、miR-155水平及潮氣呼吸肺功能指標，其中潮氣呼吸肺功能指標包括呼吸頻率(RR)、潮氣量(VT)、呼氣時間(Te)、達峰時間(TPTEF)、達峰容積(VPTEF)，達峰時間/呼氣時間(TPTEF/Te，%)=TPTEF/Te×100%，達峰容積/潮氣量(VPTEF/VT，%)=VPTEF/VT×100%。

2 結 果

2.13組兒童血清miR-222和miR-155水平比較 與健康對照組比較，輕癥組、重癥組兒童血清miR-222和miR-155水平明顯升高，且重癥組高于輕癥組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組兒童血清miR-222和miR-155水平比較

2.23組兒童潮氣呼吸肺功能比較 與健康對照組比較，輕癥組、重癥組兒童VT、TPTEF/Te和VPTEF/VT明顯降低，RR明顯升高，且重癥組較輕癥組變化更明顯，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組兒童潮氣呼吸肺功能比較

2.3血清miR-222、miR-155水平與病情嚴重程度、潮氣呼吸肺功能的相關分析 血清miR-222、miR-155水平分別與VT、TPTEF/Te、VPTEF/VT呈負相關，與病情嚴重程度、RR呈正相關(P<0.05)。見表3。

表3 血清miR-222、miR-155與病情嚴重程度、潮氣呼吸肺功能的相關分析

2.4支原體肺炎患兒病情嚴重程度的多元Logistic回歸分析 以miR-222和miR-155為自變量，病情嚴重程度為因變量，進行多元Logistic回歸分析結果顯示，miR-222、miR-155水平升高為影響支原體肺炎病情嚴重程度的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 支原體肺炎患兒病情嚴重程度的多元Logistic回歸分析

2.5支原體肺炎患兒潮氣呼吸肺功能的回歸分析 以miR-222和miR-155為自變量，潮氣呼吸肺功能為因變量，進行多元Logistic回歸分析結果顯示，miR-222、miR-155水平升高為影響支原體肺炎潮氣呼吸肺功能獨立危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 支原體肺炎患兒潮氣呼吸肺功能的多元Logistic回歸分析

3 討 論

近年來，我國兒童支原體肺炎發(fā)病率日趨升高，且有小范圍流行趨勢[8]。肺部感染支原體后，不僅會引起呼吸道病變，還可累及其他器官或系統[9]。大量研究表明，免疫[10]及炎性反應[11]與兒童支原體肺炎密切相關。miRNA在支原體肺炎發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[12]。miR-155為調控炎癥因子表達的重要miRNA。徐長娣等[13]通過miRNA芯片技術篩選支原體肺炎患兒與健康兒童血液淋巴細胞差異表達的miRNA發(fā)現，支原體肺炎患兒血液淋巴細胞中共篩選出238個具有明顯差異的miRNA，與健康兒童比較，支原體肺炎患兒血液淋巴細胞中miR-155水平明顯上調。丁瑩等[14]利用miRNA芯片技術篩選支原體肺炎患兒與健康兒童血漿差異表達的miRNA發(fā)現，支原體肺炎患兒血漿標本中共篩選出26個具有明顯差異的miRNA，與健康兒童比較，支原體肺炎患兒血漿標本中miR-222-3p表達明顯上調。故筆者猜想與miR-222-3p具有同源性的miR-222也可能在支原體肺炎中異常表達。

本研究采用RT-PCR法檢測血清miR-222和miR-155水平發(fā)現，與健康對照組比較，輕癥組與重癥組血清miR-222和miR-155水平明顯升高，符合以往研究結果[5，15]，提示miR-222和miR-155可能參與支原體肺炎發(fā)病機制，且重癥組高于輕癥組，提示miR-222和miR-155也參與了支原體肺炎進展，有可能成為判斷病情嚴重程度的指標。支原體感染可引起氣道炎性反應及氣道高反應性，導致肺功能損傷[16]。因此，肺功能檢查成為判斷病情嚴重程度及預測預后的重要手段，但兒童尤其是幼兒配合度相對較差，故相比于常規(guī)肺功能檢查，潮氣呼吸肺功能檢測可能更具有實用性，無需患兒特殊配合，且具有重復性好、操作簡便、參數穩(wěn)定等優(yōu)勢。本研究結果顯示，與健康對照組比較，輕癥組與重癥組VT、TPTEF/Te和VPTEF/VT明顯降低，RR明顯升高，重癥組變化更明顯，提示支原體肺炎患兒存在小氣道功能和阻塞性通氣功能障礙，且重癥患兒可出現限制性通氣功能障礙。相關分析得出，血清miR-222、miR-155分別與VT、TPTEF/Te、VPTEF/VT呈負相關，與病情嚴重程度、RR呈正相關，表明miR-222、miR-155與支原體肺炎病情嚴重程度、潮氣呼吸肺功能具有一定關聯。通過多元Logistic回歸分析發(fā)現，miR-222和miR-155水平升高為影響支原體肺炎病情嚴重程度和潮氣呼吸肺功能的獨立危險因素，進一步證實miR-222和miR-155在支原體肺炎病情評估和預后判斷中的重要價值。

綜上所述，支原體肺炎患兒血清miR-222和miR-155表達上調，且是影響病情嚴重程度和潮氣呼吸肺功能的重要因素，可作為病情評估和預后判斷的指標。