余 鳳，李 良，趙 靜

東南大學附屬中大醫(yī)院江北院區(qū)/南京市大廠醫(yī)院病理科，江蘇南京 210044

非小細胞肺癌(NSCLC)在肺癌中是一種常見的類型，其病死率和發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，臨床癥狀主要有咯血、氣促、咳嗽、發(fā)熱等[1-2]。有研究表明，二聚化蛋白(JDP2)是一種轉(zhuǎn)錄活化因子1的抑制物，參與腫瘤細胞遷移、分化、增殖等過程。糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1(SGK1)具有參與調(diào)控多種生理機制的功能，SGK1的活性增加和異常表達與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)具有磷酸化代謝因子、信號蛋白、細胞結(jié)構(gòu)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子等多種底物的功能，并且在腫瘤發(fā)生及細胞的生長、發(fā)育等過程中具有重要的作用[5]。本研究回顧性分析了本院收治的76例NSCLC患者的臨床資料，探討JDP2、SGK1、GSK-3β在NSCLC組織中的表達情況，以及三者的相關(guān)性，為臨床NSCLC治療方案提供數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年6月至2020年6月本院收治的76例NSCLC患者納入肺癌組，病理科均保存有NSCLC組織標本，組織類型包括腺癌42例，鱗癌34例；病程1～2年，平均(1.43±0.40)年。納入標準：所有患者均符合《NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南》中關(guān)于NSCLC的診斷標準[6]；均經(jīng)組織病理檢查確診為NSCLC；臨床病理資料完整。排除標準：合并支氣管炎、肺炎等疾?。缓喜⒚庖呦到y(tǒng)功能缺陷疾??；合并結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌等疾??；有溝通障礙或者嚴重精神??；近期內(nèi)未接受過抗腫瘤治療。選擇同期76例在本院接受過肺組織活檢，并保留有正常肺組織(距腫瘤邊緣>5 cm)的患者納入對照組。所有研究對象中男83例，女69例；年齡46～78歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為24～29 kg/m2；有吸煙史91例，嗜酒史81例。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會批準，批準文號：(2018)倫審第(58)號。

表1 兩組一般資料比較

1.2方法

1.2.1免疫組化法檢測JDP2、SGK1、GSK-3β 采用免疫組化法對NSCLC及正常肺組織中的JDP2、SGK1、GSK-3β進行檢測，具體步驟：采用4%的甲醛溶液對組織標本進行固定，采用石蠟進行包埋切片，將組織切片采用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后采用蒸餾水沖洗3次，每次3 min。隨后將切片浸入枸櫞酸緩沖液(pH值為6)中，對其加熱到100 ℃，3 min后，冷卻至37 ℃，使用PBS緩沖液將其洗滌3次，每次3 min。將3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶滴至切片上，PBS緩沖液洗滌3次，每次3 min。將小鼠抗人PAX-2、Galectin-1多克隆抗體(濃度為1∶100，購自Abbkine公司)滴至切片上，在4 ℃的溫度條件下儲存過夜；PBS緩沖液洗滌3次，在各切片中加入即用型生物素化二抗，在37 ℃的溫度條件下靜置30 min；PBS緩沖液洗滌，將辣根酶標記鏈霉卵白素工作液滴至切片上，于37 ℃的溫度下靜置20 min；DAB顯色且蘇木素復染后，用自來水沖洗3次，乙醇梯度水化，晾干后采用中性樹脂進行封片；采用DM-440倒置顯微鏡觀察JDP2、SGK1、GSK-3β表達。

1.2.2陽性結(jié)果判定 由兩位臨床經(jīng)驗>5年的醫(yī)師對陽性細胞的染色情況進行統(tǒng)計：在顯微鏡下隨機選取5個高倍視野(×400)的切片，醫(yī)師需檢測每個視野下JDP2、SGK1、GSK-3β吸光度和陽性面積，計算其平均吸光度和陽性面積的平均值。細胞核染色程度判斷：0分為未見染色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。陽性細胞百分率判斷分為4個等級：0分為<5%；1分為5%～<25%；2分為25%～<50%；3分為≥50%。最終將細胞核染色程度結(jié)果與陽性細胞百分率結(jié)果相乘計算總分，陰性為<2分，陽性為≥2分，觀察并記錄JDP2、SGK1、GSK-3β陽性表達率。

2 結(jié) 果

2.1兩組NSCLC組織中JDP2、SGK1、GSK-3β陽性表達情況比較 與對照組比較，肺癌組JDP2、GSK-3β陽性表達率較低，SGK1陽性表達率較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。JDP2、SGK1、GSK-3β在兩組組織中的免疫組化染色情況見圖1～3。

表2 兩組NSCLC組織中JDP2、SGK1、GSK-3β陽性表達情況比較[n(%)]

注：A為NSCLC組織；B為正常肺組織。

注：A為NSCLC組織；B為正常肺組織。

注：A為NSCLC組織；B為正常肺組織。

2.2不同特征NSCLC患者JDP2、SGK1、GSK-3β陽性表達情況比較 與腫瘤最大徑<3 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高分化程度患者比較，腫瘤最大徑≥3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期、低中分化程度患者JDP2、GSK-3β陽性表達率較低，SGK1陽性表達率較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腺癌患者JDP2、SGK1、GSK-3β陽性表達率與鱗癌患者比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同特征NSCLC患者JDP2、SGK1、GSK-3β陽性表達情況比較 [n(%)]

2.3JDP2、SGK1、GSK-3β對NSCLC的預測價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，JDP2、SGK1、GSK-3β預測NSCLC發(fā)生的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.657(95%CI：0.571～0.742，P<0.001)、0.695(95%CI：0.613～0.777，P<0.001)、0.704(95%CI：0.622～0.786，P<0.001)，靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值見表4。

表4 JDP2、SGK1、GSK-3β對NSCLC的預測價值(%)

2.4JDP2、SGK1、GSK-3β之間的相關(guān)性 JDP2與SGK1呈負相關(guān)(r=—0.516，P=0.004)；JDP2與GSK-3β呈正相關(guān)(r=0.991，P=0.001)；SGK1與GSK-3β呈負相關(guān)(r= —0.230，P=0.045)。

3 討 論

近年來，肺癌的發(fā)病率和病死率逐漸升高，為嚴重威脅人類身體健康的主要癌癥之一，而NSCLC在肺癌中占86%左右，并且其治愈率較低[7]。目前，治療NSCLC的主要手段是手術(shù)切除，若患者早期被發(fā)現(xiàn)，治愈率較高；若患者發(fā)現(xiàn)患病時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，病死率較高。因此，積極尋找NSCLC發(fā)病機制中的調(diào)控因素，對其治療有至關(guān)重要的作用[8-9]。

JDP2可對相應區(qū)域組蛋白進行激活、結(jié)合、修飾、轉(zhuǎn)錄，其具有抑制特異性癌基因活性的作用[10]。YU等[11]的研究顯示，當NSCLC組織中JDP2蛋白表達減少時，腫瘤細胞的增殖加快，腫瘤組織生長速度及惡性程度增加，分化程度降低，臨床分期較高。此外，一方面JDP2能夠激活腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，使腫瘤細胞生長周期加快，從而增加腫瘤組織的惡性程度；另一方面，羧基末端延伸部分與JDP2蛋白進行結(jié)合，JDP2具有促進腫瘤細胞基因分化及轉(zhuǎn)錄的作用，進而促進腫瘤惡性發(fā)展[12]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，JDP2參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制可能為組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶與JDP2結(jié)合，從而抑制腫瘤基因的轉(zhuǎn)錄及組蛋白的乙?；?，同時對腫瘤細胞的分化、增殖及生長周期停滯也具有抑制作用，進一步對腫瘤細胞的臨床分期進行抑制[13]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，JDP2在NSCLC組織中表達異常，且與患者病理特征相關(guān)[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在NSCLC組織中JDP2陽性表達率低，且與腫瘤最大徑<3 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高分化程度患者比較，腫瘤最大徑≥3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期、低中分化程度患者JDP2陽性表達率較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示JDP2表達水平降低可能是導致NSCLC發(fā)生的危險因素，進一步證實了JDP2參與NSCLC的發(fā)生、進展。ROC曲線分析顯示，JDP2預測NSCLC發(fā)生的AUC為0.657，靈敏度和特異度分別為60.31%、76.06%。

SGK1屬于糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶家族成員之一，其對機體內(nèi)的細胞增殖和凋亡、神經(jīng)元運動活力、激素的釋放等多種生理功能具有調(diào)節(jié)作用[15]。有研究證實，SGKl在惡性腫瘤組織中呈高表達，并且其對腫瘤細胞的耐藥、自噬、轉(zhuǎn)移及生長具有促進作用[16-17]，但是其在NSCLC中的作用機制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，在NSCLC組織中SGKl陽性表達率較高。與腫瘤最大徑<3 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高分化程度患者比較，腫瘤最大徑≥3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期、低中分化程度患者SGK1陽性表達率較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示SGKl表達水平異常可能參與NSCLC患者發(fā)病的過程。本研究ROC曲線分析顯示，SGKl預測NSCLC發(fā)生的AUC為0.695，提示SGKl可能是NSCLC發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移及分化的警示指標，分析其原因可能為SGKl可導致集落刺激因子l或者糖皮質(zhì)激素誘導細胞運動性、黏附能力、細胞侵襲性增強，若抑制SGKl表達，可減緩腫瘤細胞增殖及其腫瘤組織的惡性程度，但目前臨床鮮有研究分析SGKl與NSCLC的關(guān)系，因此，上述結(jié)果還需后續(xù)研究進一步分析驗證。

GSK-3β在Wnt信號通路中是一種重要的糖原合成酶激酶，其能夠阻斷Wnt信號通路，在抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展中是一個較為關(guān)鍵的因子，在β-連環(huán)蛋白氨基末端的4個位點中加入其磷酸根，能夠抑制Wnt信號的傳導[18-19]。GSK-3β被認為是腫瘤潛在的調(diào)控因子，而GSK-3β在Wnt/β-catenin信號通路中的調(diào)節(jié)功能已被廣泛認可，細胞增殖活化異常及腫瘤形成與異常激活的Wnt信號靶基因之間關(guān)系密切，而GSK-3β磷酸化細胞核β-catenin后可抑制其過程[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中GSK-3β陽性表達率低于正常肺組織，GSK-3β陽性表達率與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤最大徑有密切的關(guān)系，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑≥3 cm、TNM分期Ⅲ期、低中分化程度的NSCLC組織中陽性表達率較低。分析原因：GSK-3β能夠促進線粒體介導死亡內(nèi)源性細胞凋亡，使死亡受體介導的外源性細胞凋亡受到抑制，進而調(diào)節(jié)細胞分裂周期、基因轉(zhuǎn)錄及細胞骨架的完整性[21]。黃曌等[22]研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β在NSCLC中表達降低，認為其參與此病的發(fā)生及進展。本研究ROC曲線分析顯示，GSK-3β預測NSCLC發(fā)生的AUC為0.704，是預測NSCLC發(fā)生的高能預警指標。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，JDP2、SGK1、GSK-3β三者間具有相關(guān)性。

綜上所述，NSCLC患者在分化程度較低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑≥3 cm、TNM分期Ⅲ期時JDP2、GSK-3β陽性表達率明顯降低，SGK1陽性表達率明顯升高，說明JDP2、SGK1、GSK-3β與NSCLC發(fā)生關(guān)系密切。