劉小莉，鄒 明，張 靜，張紅梅

四川省骨科醫(yī)院檢驗科，四川成都 610041

骨關節(jié)炎是以關節(jié)表面軟骨遭到破壞，而周圍骨性組織增生為病理特征的關節(jié)病，可導致受累關節(jié)產生疼痛，活動時加重，久不活動時有僵硬感[1]。骨關節(jié)炎在年齡超過50歲的人群中發(fā)病率較高，嚴重影響中老年人的身體健康及生活質量。骨關節(jié)炎病變部位分泌物的檢測對反映關節(jié)代謝狀態(tài)有重要作用，檢測其中特異性分子將有助于判斷該病的病理變化，對臨床早期診斷具有重要意義[2]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種促炎性細胞因子，參與免疫反應、炎性反應等，在重癥類風濕關節(jié)炎患者血液中可發(fā)現(xiàn)TNF-α升高[3]。鈣網(wǎng)織蛋白(CRT)是一種內質網(wǎng)主要鈣結合蛋白，參與機體多種生理、病理過程。研究報道，CRT與類風濕關節(jié)炎患者關節(jié)滑膜炎性反應和血管形成有關[4]。目前，對于中老年骨關節(jié)炎患者體內TNF-α、CRT水平的相關研究較少。本研究以95例中老年骨關節(jié)炎患者為研究對象，探討中老年骨關節(jié)炎患者體內TNF-α、CRT表達情況，并分析二者水平與疾病嚴重程度的關系，為中老年骨關節(jié)炎的臨床診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2020年2月本院收治的95例中老年骨關節(jié)炎患者納入病例組。納入標準：(1)符合骨關節(jié)炎診斷標準[5]，X線片等影像學檢查結果顯示滑膜、骨贅增生，半月板、側副韌帶磨損及膝關節(jié)內外翻畸形；(2)年齡55～80歲；(3)對本研究內容知情，并簽署同意書。排除標準：(1)合并急性或慢性感染性疾病、出血性疾病；(2)合并嚴重骨質疏松、骨纖維異?；蚬切匀诤?；(3)合并心、肝、腎、肺功能障礙。病例組包括男55例，女40例；年齡55～80歲，平均(65.12±2.07)歲；病程1～5年，平均(3.46±1.03)年；單膝患病83例，雙膝患病12例；病理類型包括軟骨型12例，滑膜型18例，游離體型7例，半月板型15例，混合型43例。根據(jù)Michel Lequesen膝骨關節(jié)炎嚴重度分級指數(shù)(ISOA)[6]將95例中老年骨關節(jié)炎患者分為中度組30例，重度組46例，極重度組19例。另外選取同期因交叉韌帶斷裂行手術治療的患者60例為對照組，留取其滑膜液和手術切除的正?；そM織，其中：男29例，女31例；年齡56～80歲，平均(64.52±4.67)歲。病例組和對照組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院醫(yī)學倫理委員會審批通過。

1.2方法

1.2.1獲取關節(jié)滑膜組織和滑膜液 在關節(jié)鏡檢查或行膝關節(jié)腔穿刺、沖洗術及其他相應手術時，注入1.0 mL的生理鹽水，反復回抽、注入3遍，將最后一次抽出的液體注入生化管中，以3 000 r/min離心5 min，于20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取關節(jié)滑膜組織，大小2 cm×2 cm，甲醛固定，室溫保存。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測TNF-α、CRT水平 采用ELISA法檢測滑膜液中TNF-α、CRT水平，ELISA法檢測試劑盒由默沙克生物科技有限公司提供。

1.2.3吸光度值(A值)檢測 吸取100 μL關節(jié)滑膜液、稀釋標準品，36%孵箱避光孵育90 min，加入生物素化抗體，孵育60 min，加入酶結合物，再次孵育30 min，加入顯色底物孵育15 min，加入終止液，于450 nm波長檢測A值，繪制標準曲線。

1.2.4免疫組化法檢測滑膜組織中TNF-α、CRT表達情況 取滑膜組織標本，浸臘包埋后，依次進行切片、烤片、脫蠟水化、封閉內源性酶；BSA溶液孵育1 h，加入兔抗人TNF-α抗體及CRT抗體，孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染細胞，并進行脫水、透明、封片，觀察結果。陽性細胞呈棕褐色，陰性表達呈淡黃色或淺棕色。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；等級資料相關分析采用Spearman相關。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1不同嚴重程度骨關節(jié)炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平比較 中度組、重度組、極重度組骨關節(jié)炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；重度組、極重度組骨關節(jié)炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平明顯高于中度組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，極重度組骨關節(jié)炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平明顯高于重度組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同嚴重程度骨關節(jié)炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平比較

2.2滑膜組織中TNF-α、CRT的表達情況 正?；そM織中未見TNF-α表達(圖1A)，TNF-α在中老年骨關節(jié)炎滑膜組織中呈陽性表達，表達位于滑膜襯里層，且有大量炎性細胞浸潤(圖1B)；CRT在正?；そM織中呈陰性表達(圖1C)，在中老年骨關節(jié)炎滑膜組織中呈陽性表達，表達主要位于血管周圍和滑膜襯里層，表達量較低(圖1D)。

2.3各組滑膜組織中TNF-α、CRT的A值比較 中度組、重度組、極重度組骨關節(jié)炎患者滑膜組織中TNF-α、CRT的A值明顯大于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；重度組、極重度組骨關節(jié)炎患者滑膜組織中TNF-α、CRT的A值明顯大于中度組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，極重度組骨關節(jié)炎患者滑膜組織中TNF-α、CRT的A值明顯大于重度組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組滑膜組織中TNF-α、CRT的A值比較

注：A為正?；そM織中TNF-α表達情況；B為中老年骨關節(jié)炎滑膜組織中TNF-α表達情況；C為正常滑膜組織中CRT表達情況；D為中老年骨關節(jié)炎滑膜組織中CRT表達情況。

2.4滑膜液TNF-α、CRT水平與骨關節(jié)炎嚴重程度的相關性分析 TNF-α、CRT水平與骨關節(jié)炎嚴重程度呈正相關(r=0.667，P<0.001；r=0.704，P<0.001)。

3 討 論

骨關節(jié)炎是一種慢性關節(jié)病，表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、關節(jié)變形及關節(jié)活動受限等。中老年人是骨關節(jié)炎高發(fā)群體，75歲以上人群中發(fā)病率高達80%，60歲以上人群中發(fā)病率為50%[7]。該病的發(fā)生與肥胖、衰老、炎性反應及創(chuàng)傷等多種因素有關。人體關節(jié)表面有一層光滑組織，主要保證關節(jié)活動順暢性，而老年人許多組織器官開始衰老，關節(jié)軟骨磨損變薄，關節(jié)邊緣形成骨刺，進而引發(fā)骨關節(jié)退行性病變[8-9]。隨著分子生物學不斷發(fā)展，血清中分子標志物的檢測成為臨床判斷各種疾病進展的重要輔助手段。

TNF-α作為常見促炎性細胞因子，參與局部炎性反應，具有殺傷靶細胞、促細胞凋亡及內皮細胞活化作用，參與許多關節(jié)疾病，如類風濕關節(jié)炎、骨關節(jié)炎等。楊榮等[10]發(fā)現(xiàn)，膝關節(jié)炎患者血清中TNF-α水平明顯上升，并隨著關節(jié)炎嚴重程度的增加呈不斷升高趨勢。趙娜等[11]的研究顯示，創(chuàng)傷性膝骨關節(jié)炎患者血清中TNF-α水平[(41.40±14.63)ng/L]明顯高于健康對照者[(24.53±10.37)ng/L]。TNF-α在骨關節(jié)炎發(fā)病機制中最關鍵的作用是上調基質金屬蛋白酶的表達，誘導炎性反應發(fā)生，還可刺激軟骨細胞合成白細胞介素(IL)-6、IL-8等，進一步增加炎性反應[12]。本研究結果顯示：對照組TNF-α水平明顯低于中度組、重度組和極重度組骨關節(jié)炎患者，重度組、極重度組骨關節(jié)炎患者滑膜液中TNF-α水平明顯高于中度組，極重度組骨關節(jié)炎患者明顯高于重度組，即TNF-α表現(xiàn)為隨病情加重逐漸上升趨勢；TNF-α在正?；そM織中呈陰性表達，在骨關節(jié)炎患者滑膜組織中呈陽性表達，A值的變化趨勢與其在滑膜液中的變化情況一致。經相關性分析發(fā)現(xiàn)，TNF-α水平與中老年骨關節(jié)炎嚴重程度呈正相關(r=0.667，P<0.001)，說明TNF-α能夠促進中老年骨關節(jié)炎進展，加重病情，這主要與TNF-α對關節(jié)軟骨的破壞有關，其通過刺激軟骨降解酶及介導前列腺素合成分泌，破壞軟骨組織，促進骨吸收。CRT是內質網(wǎng)鈣結合蛋白，普遍存在于生物細胞中，在細胞質、細胞表面及細胞外基質中均有表達。研究報道，CRT參與類風濕關節(jié)炎的病理過程，與患者關節(jié)滑膜炎性反應有緊密聯(lián)系[13]?；ぱ荇璧男纬墒顷P節(jié)炎的重要病理表現(xiàn)，新生血管向滑膜液輸送炎癥細胞，同時為滑膜異常增生提供氧氣和營養(yǎng)物質，使滑膜長期處于炎性反應狀態(tài)，增加血管翳的侵襲性[14]。CRT可通過多種途徑參與血管翳的形成，其中關節(jié)炎的共享表位是其主要作用途徑，通過該途徑參與固有免疫的信號轉導，最終促使血管翳形成[15]。丁紅梅等[16]研究發(fā)現(xiàn)，活動期類風濕關節(jié)炎患者體內CRT水平較穩(wěn)定期高，同時與IL-6、TNF-α等炎癥因子水平呈正相關。本研究發(fā)現(xiàn)：CRT在病例組各亞組患者滑膜液及滑膜組織中的水平均高于對照組，同時隨著疾病嚴重程度呈不斷上升趨勢，提示該指標與骨關節(jié)炎疾病進程有一定關系。相關分析顯示，CRT水平與骨關節(jié)炎疾病嚴重程度呈正相關(r=0.704，P<0.001)，提示CRT會加重老年骨關節(jié)炎病情。本研究還發(fā)現(xiàn)：TNF-α在中老年骨關節(jié)炎滑膜組織中的表達位于滑膜襯里層，有大量炎性細胞浸潤；CRT表達主要位于血管周圍和滑膜襯里層，表達量較低。

綜上所述，中老年骨關節(jié)炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平升高，并隨著病情加重呈上升趨勢，二者水平與該病嚴重程度呈正相關。TNF-α、CRT有望成為臨床診斷中老年骨關節(jié)炎的潛在血清學指標。