高山，高巖，楊俊省，田濤

（棗莊市立醫(yī)院腫瘤科，山東 棗莊 277100）

肺癌是我國(guó)目前發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤[1]，其中非小細(xì)胞肺癌占80%～85%，大部分患者檢出時(shí)已為晚期[2]。近年來(lái)，非小細(xì)胞肺癌的傳統(tǒng)化療未見(jiàn)突破性進(jìn)展，且副反應(yīng)嚴(yán)重。2000 年，表皮因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）—吉非替尼（Gefitinib）首次被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療，并獲得很好的療效[3]。EGFR 是NSCLC 患者接受酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）如易瑞沙、伊瑞可等靶向藥物治療的重要生物標(biāo)記物，我國(guó)衛(wèi)生部門(mén)要求NSCLC 患者在接受靶向藥物治療之前必須進(jìn)行EGFR 檢測(cè)。組織活檢是癌癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但組織活檢存在操作風(fēng)險(xiǎn)較高、組織樣本獲得困難、無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等缺點(diǎn)。而血液、胸腔積液EGFR 檢測(cè)是一種方便、快捷、新興的非侵入性檢測(cè)方法。本研究收集2019 年1 月—2020 年10 月我院送檢的非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織、血液、胸腔積液標(biāo)本，檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織、血液及胸腔積液中EGFR 第19 和21 外顯子的突變狀態(tài)，初步探討組織EGFR 與血液、胸腔積液陽(yáng)性檢出率的關(guān)系，以期指導(dǎo)晚期非小細(xì)胞肺癌患者臨床用藥，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2019 年1 月—2020 年10 月確診為NSCLC患者并行EGFR 基因檢測(cè)的病例269 例，另收集同期進(jìn)行腫瘤組織、血液、胸腔積液EGFR 檢測(cè)的NSCLC患者54 例，EGFR-TKI 耐藥后同時(shí)行血液及胸腔積液T790M 檢測(cè)的患者23 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①組織學(xué)證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌的患者；②胸腔積液患者均通過(guò)CT 或者彩超診斷有胸腔積液且能夠穿刺引流出積液；③確保所獲得的標(biāo)本能滿(mǎn)足檢測(cè)需要；④患者組織病理分型參考20115 版世界衛(wèi)生組織（WHO）的肺癌組織學(xué)分類(lèi)，根據(jù)第8 版國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)（IASLC）的肺癌TNM分期進(jìn)行入選標(biāo)本的臨床分期；⑤患者及家屬知情同意，并簽署知情同意書(shū)；⑥該研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集

①組織標(biāo)本采集：收集來(lái)自我院經(jīng)皮肺穿刺、電子支氣管鏡的活檢組織，用4%中性緩沖的甲醛進(jìn)行標(biāo)本的固定。②細(xì)胞標(biāo)本采集：收集我院胸腔積液患者，進(jìn)行胸腔穿刺置管引流術(shù)，將首次引流出的液體樣品以1 500 rpm 離心5 min，離心半徑13.5 cm，并吸取約30 ml 透明上清液直接送檢。③血液標(biāo)本采集：常溫下采集全血后輕搖混勻，離心，分離出血漿。使用含有游離DNA 保護(hù)劑及防細(xì)胞裂解保護(hù)劑的采血管。

1.3 方法

①液體標(biāo)本游離核酸提取步驟：取樣：將液體樣本充分振蕩混勻，然后將樣本取2 ml 加入到一個(gè)單獨(dú)的 15 ml試管中；加裂解液：樣本中加入250 μl 的PK+2 ml 的DNA PBB，混勻；裂解樣本：室溫下（15～30 ℃）孵育30 min；DNA 吸附至膜上：加入500 μl 異丙醇，混勻后移入HPEA FT 中，離心；清洗膜1：500 μl 的WB Ⅰ工作液加入到FT 中，離心；清洗膜2：500 μl的WB Ⅱ工作液加入到FT 中，離心；清洗膜3：500 μl的WB Ⅱ工作液加入到FT 中，離心；干燥過(guò)濾膜：16 000×g 離心1 min；洗脫液孵育：100 μl DNA EB 加入到FT 濾膜的中心，室溫下孵育FT 及洗脫管5 min；洗脫DNA：8 000×g 離心FT 及洗脫1 min；收集洗脫液于洗脫管中，混勻后的DNA 儲(chǔ)備溶液可用于PCR 檢測(cè)。②組織標(biāo)DNA 提?。簶颖久撓灒簩⒔M織在二甲苯浸泡組織5 min，再無(wú)水乙醇容器中浸泡5 min；取樣：從玻片中刮下組織放入1.5 ml 離心管；加裂解液：樣品管中加入DNA TLB 和PK；裂解樣本：56 ℃干浴加熱器中孵育60 min；去交聯(lián)：90 ℃干浴加熱器中孵育60 min；DNA 吸附至膜上：加入200 μl DNA 結(jié)合緩沖液（DNA PBB）+100 μl 異丙醇，混勻，離心；清洗膜1：500 μl 的WB Ⅰ工作液加入到FT 中，離心；清洗膜2：500 μl 的WB Ⅱ工作液加入到FT 中，離心；清洗膜3：500 μl 的WB Ⅱ工作液加入到FT 中，離心；干燥過(guò)濾膜：16 000×g 離心1 min；洗脫液孵育：100 μl DNA EB 加入到FT 濾膜的中心，室溫下孵育FT及洗脫管5 min；洗脫DNA：8 000×g 離心FT 及洗脫1 min。③熒光PCR 法檢測(cè)EGFR 的操作步驟：RNA質(zhì)量檢測(cè)：采用紫外吸收法測(cè)定RNA 溶液濃度和純度；樣品cDNA 合成；按照變性、退火、延伸進(jìn)行循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）] 表示， 采用χ2檢驗(yàn)， 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同標(biāo)本基因突變的用Kappa 檢驗(yàn)（Kappa＞0.77 為一致性好，0.4～0.77 為一致性良好，＜0.4 為一致性差）。

2 結(jié)果

2.1 EGFR 基因突變與NSCLC 患者性別、病理類(lèi)型的關(guān)系

NSCLC 腫瘤組織標(biāo)本中EGFR 突變率為47.58%（128/269），其中女性突變率高于男性，腺癌突變率高于鱗癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 EGFR 突變與非小細(xì)胞肺癌臨床、病理類(lèi)型關(guān)系（n，%）

2.2 腫瘤組織、血液、胸腔積液中EGFR 基因突變檢測(cè)

在NSCLC 患者并行EGFR 基因檢測(cè)的病例269 例中，腫瘤組織中EGFR 突變率為為47.58%（128/269），其中19 外顯子突變占32.03（41/128），低于21 外顯子L858R 突變的62.50%（80/128）。血液標(biāo)本中EGFR突變率為36.90%（31/84），其中19 外顯子突變占32.25%（10/31），低于L858R 突變的64.51%（20/31）；胸腔積液標(biāo)本中EGFR 突變率41.54%（27/65），其中19 外顯子突變占29.63%（8/27），低于L858R 突變的66.67%（18/27），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 組織、血液、胸腔積液標(biāo)本中主要突變類(lèi)型比較（n，%）

2.3 NSCLC 患者中同時(shí)檢測(cè)組織、血液、胸腔積液中EGFR 突變率比較

54 例同時(shí)檢測(cè)組織、血液、胸腔積液患者中組織檢測(cè)突變型26 例，突變率48.14%（26/54）；血液檢測(cè)突變型21 例，突變率38.89%（21/54）；胸腔積液檢測(cè)突變型22 例，突變率40.74%（22/54）；54 例患者中血液突變率為38.89%，與對(duì)應(yīng)的腫瘤組織突變率的48.14%相比，對(duì)EGFR 突變的檢出具有較好的一致性（Kappa=0.72）。胸水突變率為40.74%，與對(duì)應(yīng)的腫瘤組織突變率的48.14%相比，對(duì)EGFR 突變的檢出具有極好的一致性（Kappa=0.84）。

2.4 NSCLC 血液中T790M 突變檢測(cè)

23 例EGFR-TKI 治療耐藥患者的胸水和血液樣本中，胸水中檢出15 例T790M 基因突變，突變率為65.22%（15/23）；血液中檢出11 例T790M 突變，突變率為52.17%（11/23）；胸水T790M 突變率略高于血液突變率，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.415，P＞0.05）。

3 討論

3.1 血液、胸腔積液與對(duì)應(yīng)的腫瘤組織EGFR 突變的一致性

液體活檢技術(shù)（血清、胸腹腔積液等）作為一種新興的檢測(cè)方法，由于其非侵入性、方便、快捷和較高的可靠性等優(yōu)點(diǎn)已越來(lái)越多地被應(yīng)用于臨床，其中的信息為腫瘤患者的個(gè)性化醫(yī)療提供有力的依據(jù)[4]。研究表明[5]，組織DNA 和循環(huán)DNA 一致性較好；且美國(guó)胸科醫(yī)師學(xué)會(huì)循證臨床實(shí)踐指南指出[6]，胸水細(xì)胞學(xué)診斷敏感性平均為63%。Liu X 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，胸水細(xì)胞與組織樣本的一致率為81%。本研究結(jié)果顯示，血液與對(duì)應(yīng)的腫瘤組織相比，對(duì)EGFR 突變的檢出具有較好的一致性（Kappa=0.62）；胸水與對(duì)應(yīng)的腫瘤組織相比，對(duì)EGFR 突變的檢出具有極好的一致性（Kappa=0.84），因本實(shí)驗(yàn)納入的患者同時(shí)檢測(cè)腫瘤組織、血液、胸腔積液，所以更具對(duì)比性、可靠性。這樣對(duì)于一些老年患者、失去組織活檢機(jī)會(huì)的患者，仍可以通過(guò)血液、胸腔積液檢測(cè)EGFR 突變狀態(tài)。

3.2 EGFR 基因突變與NSCLC 患者性別、病理類(lèi)型的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示，女性EGFR 突變率高于男性，腺癌EGFR 突變率高于鱗癌（P＜0.05）。無(wú)論在腫瘤組織、血液還是胸腔積液，21 外顯子L858R 突變率高于19 外顯子突變（P＜0.05）。Zhang YX 等[8]研究顯示，EGFR-TKI 治療19 外顯子缺失突變可以得到一個(gè)比21外顯子點(diǎn)突變更長(zhǎng)的PFS。通過(guò)以上EGFR 與臨床病理之間的關(guān)系及突變位點(diǎn)的比較，能指導(dǎo)臨床方案的選擇。臨床中可以建議女性NSCLC 患者行EGFR 檢測(cè)，可以較男性患者更能從EGFR-TKI 藥物治療中獲益。雖然腺癌的EGFR 突變率遠(yuǎn)高于鱗癌，但仍建議鱗癌患者行EGFR 檢測(cè)，因?yàn)槿杂?0%左右的鱗癌患者能從EGFR-TKI 藥物中獲益。

3.3 NSCLC 血液與胸水中T790M 突變檢測(cè)比較

研究發(fā)現(xiàn)[9]，使用EGFR-TKI 治療后進(jìn)展的腫瘤中，50%存在EGFR 基因20 號(hào)外顯子第790 位點(diǎn)的突變，即T90M 基因突變。轉(zhuǎn)染攜帶T790M 基因突變的質(zhì)粒的腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI 的耐藥性明顯增加。三代TKI（奧西替尼）可用于一線(xiàn)TKI 治療進(jìn)展同時(shí)檢出T790M突變的患者，并能帶來(lái)長(zhǎng)達(dá)13 個(gè)月的中位PFS[10]。本研究中23 例EGFR-TKI 治療耐藥患者的血液T790M 突變率為52.17%，低于胸水中突變率的65.22%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示對(duì)于并發(fā)胸腔積液的患者，優(yōu)先選擇胸水檢測(cè)，而同時(shí)檢測(cè)可以提高檢出率，因此即使EGFR-TKI 耐藥，仍有50%以上的患者可從三代TKI（奧西替尼、阿美替尼）獲益。

綜上所述，女性、腺癌患者EGFR 突變較男性、鱗癌患者突變率高，更能從EGFR-TKI 藥物中獲益；血液、胸腔積液與腫瘤組織相比，對(duì)EGFR 突變的檢出具有良好的一致性，在失去組織活檢的NSCLC 患者，仍可以通過(guò)血液、胸腔積液檢測(cè)EGFR 突變狀態(tài)；對(duì)于一代耐藥的NSCLC 患者，密切監(jiān)測(cè)T790M 突變狀態(tài)，仍有50%以上的患者從三代藥物（奧西替尼、阿美替尼）中獲益。