鄂維建， 蘆永良， 祁秉民， 龐明泉， 王志鑫， 張靈強(qiáng)， 樊海寧

青海大學(xué)附屬醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科， b.肝膽胰外科， 西寧 810001

多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis，AE)是我國(guó)最危險(xiǎn)的寄生蟲(chóng)病之一，潛伏期較長(zhǎng)，且早期通常無(wú)明顯癥狀[1-2]。多房棘球蚴的肝內(nèi)定植和持續(xù)增殖通常會(huì)引起嚴(yán)重的肝臟肉芽腫性炎癥反應(yīng)，形成“免疫抑制”微環(huán)境，導(dǎo)致免疫細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞)在病灶周?chē)罅拷?rùn)[3]，其中增加的巨噬細(xì)胞迅速浸潤(rùn)肉芽腫，數(shù)量遠(yuǎn)超過(guò)T淋巴細(xì)胞，這說(shuō)明巨噬細(xì)胞是肝AE組織浸潤(rùn)的主要細(xì)胞群之一。然而，由于巨噬細(xì)胞具有明顯的異質(zhì)性和功能多樣性，其在A(yíng)E發(fā)病中的作用尚未完全闡明[4]。本研究旨在討論巨噬細(xì)胞極化(促炎性M1巨噬細(xì)胞和抗炎性M2巨噬細(xì)胞)與AE肝纖維化的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2018年9月—2020年10月期間，在本院肝膽胰外科住院治療的AE患者120例(男49例，女71例，年齡為18～77歲，中位年齡40歲)作為AE組。符合世界衛(wèi)生組織AE非正式工作小組2003年版分型標(biāo)準(zhǔn)[5]和中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)外科醫(yī)師分會(huì)包蟲(chóng)病外科專(zhuān)業(yè)委員會(huì)2015年版專(zhuān)家共識(shí)[6]，根據(jù)常規(guī)腹部磁共振成像(MRI)-DWI檢查診斷為AE，接受部分肝切除術(shù)，收集活檢組織標(biāo)本。術(shù)前未接受任何相關(guān)治療如抗寄生蟲(chóng)化療、保肝藥物、經(jīng)皮肝穿刺膽道外引流術(shù)等。術(shù)前Child-Pugh肝功能分級(jí)為A～B級(jí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)急性和慢性病毒感染和自身免疫性疾病；(2)風(fēng)濕性疾病和惡性腫瘤；(3)與棘球蚴病感染沒(méi)有直接關(guān)系的感染性疾病，包括嚴(yán)重呼吸道感染、肝膽管感染、敗血癥和高熱；(4)長(zhǎng)期使用抗炎藥物，包括激素類(lèi)、非甾體抗炎藥和阿片類(lèi)藥物。另外從醫(yī)院血庫(kù)捐獻(xiàn)者中選取33例健康對(duì)照者(年齡、性別相匹配)，其中男20例，女13例，平均年齡45.42(20～73)歲。血常規(guī)檢查、心電圖和B超檢查均無(wú)明顯異常。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 資料收集 所有患者均記錄了身高、體質(zhì)量、職業(yè)、民族及是否有肝性腦病的基本資料。通過(guò)腹部超聲檢查評(píng)估肝臟腫塊的位置、數(shù)量、橫徑、縱徑及腹水情況。另外，根據(jù)Knodell的組織學(xué)活動(dòng)指數(shù)(Histologicalactivity index，HAI)進(jìn)行炎癥評(píng)分。

1.2.2 獲取血液樣本和組織樣本 (1)血液樣本：對(duì)照組受試者于入組后靜坐20 min后、觀(guān)察組患者于手術(shù)治療前1 h分別采集外周靜脈血置于離心管中，4 ℃環(huán)境下3000 r/min離心25 min，留取血清待測(cè)。(2)組織樣本：將觀(guān)察組患者切除肝臟標(biāo)本分為距病灶中心≤2 cm的肝組織及距病灶中心>2 cm的正常肝組織，兩組肝臟樣本均用10%甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋后制成3 μm切片，用于蘇木精-伊紅染色(HE)和Masson三色染色分析。

1.2.3 HE染色及肝纖維化分級(jí) 將切片置于60 ℃的烘箱中2 h烤片后，依次用二甲苯I、II脫蠟，梯度乙醇溶液水化。滴加蘇木素染液5 min后，1%鹽酸酒精分化5～10 s。伊紅染液二次染色3 min，再依次從低濃度至高濃度順序用乙醇溶液脫水。最后用二甲苯透明后干燥封片。由同一組經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生對(duì)組織切片進(jìn)行Metavir纖維化分期：F0表示無(wú)肝纖維化；F1表示門(mén)靜脈區(qū)域纖維化；F2表示肝纖維化并不局限于門(mén)靜脈區(qū)域，還包括肝小葉部分；F3表示肝小葉中央靜脈纖維化；F4表示假小葉形成，甚至發(fā)展成肝硬化(圖1、2)。

注：a，距病灶中心>2 cm的正常肝組織；b，距病灶中心≤2 cm的肝組織。

注：a，距病灶中心>2 cm的正常肝組織；b，距病灶中心≤2 cm的肝組織。

1.2.4 血清巨噬細(xì)胞相關(guān)因子檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ，試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司。

1.3 倫理學(xué)審查 研究方案得到了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均提供了書(shū)面的知情同意書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 2組基線(xiàn)資料比較 AE組和正常對(duì)照組性別及年齡差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；2組人群其他指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 AE組和正常對(duì)照組人群基線(xiàn)資料

2.2 2組人群血清IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1水平比較 AE組IL-6、TNFα、TGFβ1水平均顯著高于正常對(duì)照組(P值均<0.05)(表2)。

表2 2組人群血清IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1水平分析

2.3 血清IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1與肝AE患者肝纖維化的關(guān)系 利用Masson染色法觀(guān)察膠原沉積區(qū)域。結(jié)果顯示，距病灶中心>2 cm的正常肝組織肝門(mén)區(qū)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維較少或無(wú)。而距病灶中心≤2 cm的肝組織肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞排列紊亂，體積增大，核溶解，藍(lán)藻纖維組織明顯增生和沉積。比較不同肝纖維化程度肝AE患者的血清學(xué)指標(biāo)，隨著肝纖維化程度的加重，IL-6、TNFα水平明顯升高，其中肝纖維化F4級(jí)患者的IL-6、TNFα水平最高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；肝AE患者的TGFβ1水平也隨著肝纖維化程度加重而升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，但F4級(jí)患者的TGFβ1水平有低于F3級(jí)的趨勢(shì)。經(jīng)Spearman分析，血清IL-6(r=0.530，P<0.001)、TNFα(r=0.758，P<0.001)、TGFβ1(r=0.567，P<0.001)水平與Metavir纖維化評(píng)分均呈正相關(guān)性，而血清IL-10(r=-0.288，P=0.001)與Metavir纖維化評(píng)分則呈負(fù)相關(guān)性(表3、圖3)。

2.4 單因素及多因素logistic回歸分析血清巨噬細(xì)胞相關(guān)因子與AE肝纖維化的關(guān)系 經(jīng)單因素和多因素logistic回歸分析，血清IL-6、TNFα水平升高是肝AE患者發(fā)生肝纖維化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P值均<0.05)(表4)。

2.5 ROC曲線(xiàn)分析血清學(xué)檢查對(duì)肝AE患者發(fā)生肝纖維化的診斷價(jià)值 經(jīng)ROC曲線(xiàn)分析，血清學(xué)檢查聯(lián)合IL-6、TNFα對(duì)于肝纖維化的診斷敏感度和特異度分別為88.4%和95.8%，AUC為0.951(95%CI：0.937～0.964)，均高于IL-6、TNFα、包蟲(chóng)抗體IgG單獨(dú)診斷(Z值分別為-3.458、-4.011、2.379，P值均<0.05)(表5)。

2.6 血清IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1與肝AE患者HAI評(píng)分的關(guān)系 經(jīng)Spearman分析，血清IL-6(r=0.560，P<0.001)、TNFα(r=0.644，P<0.001)、TGFβ(r=0.465，P<0.001)水平與HAI評(píng)分均呈正相關(guān)性，而血清IL-10(r=-0.232，P=0.011)與HAI評(píng)分則呈負(fù)相關(guān)性(圖4)。

表3 血清IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1與肝AE患者肝纖維化的關(guān)系分析

圖3 血清IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1與肝AE患者M(jìn)etavir纖維化評(píng)分的關(guān)系分析

表4 單因素和多因素logistic回歸分析肝AE患者發(fā)生肝纖維化的相關(guān)因素

表5 AE組患者血清IL-6、TNFα水平聯(lián)合診斷肝纖維化的臨床價(jià)值

圖4 血清IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1與肝AE患者HAI評(píng)分的關(guān)系分析

3 討論

肝臟是多房棘球絳蟲(chóng)感染的主要靶器官，肝AE雖為良性疾病，但形態(tài)上與肝癌相似，并能通過(guò)局部侵襲、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散至肺、腦、腎等器官[7]。免疫應(yīng)答在A(yíng)E疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，有研究表明蟲(chóng)體對(duì)宿主機(jī)體的免疫系統(tǒng)有影響，其可通過(guò)調(diào)節(jié)固有免疫及獲得性免疫來(lái)逃逸宿主的免疫追擊，創(chuàng)造蟲(chóng)體長(zhǎng)期寄生的條件[8]。因此本研究對(duì)屬固有免疫的巨噬細(xì)胞極化相關(guān)因子與AE疾病的相關(guān)性進(jìn)行研究。

巨噬細(xì)胞作為具有異質(zhì)性、可塑性的免疫細(xì)胞，可以極化成M1巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞。損傷的肝組織中肝細(xì)胞索排列紊亂、細(xì)胞間間隙擴(kuò)張還伴隨著炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，若肝損傷持續(xù)未愈會(huì)導(dǎo)致肝纖維化，目前已有很多研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞極化參與著肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[9-10]。例如劉新等[11]對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型的肝纖維化進(jìn)程中M1及M2型巨噬細(xì)胞表型改變情況進(jìn)行分析，證實(shí)隨著小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞、肝纖維化生成，M2/M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)比值在進(jìn)展中呈先減小后逐漸增大的趨勢(shì)，其中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD11c mRNA先升高后降低，而M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206、Arg-1 mRNA則在下降后逐漸升高。因此作者推斷在肝纖維化過(guò)程中，巨噬細(xì)胞極化是由M1型主導(dǎo)逐漸演變?yōu)镸2型主導(dǎo)的過(guò)程。而如CD11c等此類(lèi)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物可表示M1型巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)，相同的CD206等M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物也提示著M2型巨噬細(xì)胞的活性。M1型巨噬細(xì)胞可以分泌促炎細(xì)胞因子(如IL-6、IL-12、TNFα、IL-18等)[12]、釋放趨化因子招募其他免疫細(xì)胞、誘導(dǎo)Th1反應(yīng)發(fā)生，使肝組織持續(xù)處于炎癥階段、促纖維化生成；而M2型巨噬細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)與寄生蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)、真菌感染關(guān)系密切，其可分泌抑炎因子(如IL-10、TGFβ1等)，招募中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，具有抑制炎癥反應(yīng)及纖維化作用，加速肝損傷后的肝組織修復(fù)[13]。

此外，有研究[14-16]發(fā)現(xiàn)在器官組織纖維化進(jìn)展中，巨噬細(xì)胞極化與TGFβ1/Smad調(diào)節(jié)起著重要作用，如Smad3和Smad4阻斷TGFβ1的信號(hào)傳導(dǎo)有利于抑制巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)而抑制相關(guān)疾病進(jìn)展。例如槲皮素能夠抑制肝纖維化肝組織中巨噬細(xì)胞M1型極化及M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)的炎性細(xì)胞因子IL- 1β、IL-6水平，從而減輕四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化進(jìn)展[17]。此外由寄生蟲(chóng)引起的肝纖維化與巨噬細(xì)胞極化也密切相關(guān)，如陳聰?shù)萚18]證實(shí)血吸蟲(chóng)感染肝臟細(xì)胞后，Kupffer細(xì)胞以及血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵產(chǎn)生的可溶性抗原會(huì)激活CD4+T淋巴細(xì)胞，使其募集大量巨噬細(xì)胞和炎性細(xì)胞至病灶，促使肉芽腫和肝纖維化進(jìn)展，而M1巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞的形成及相互轉(zhuǎn)換與肝纖維化密切相關(guān)。因此本研究結(jié)果也證實(shí)AE組的IL-6、TNFα、TGFβ1水平顯著高于正常對(duì)照組，且血清IL-6、TNFα水平升高是肝AE患者發(fā)生肝纖維化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，同時(shí)經(jīng)ROC曲線(xiàn)分析，血清學(xué)檢查聯(lián)合IL-6、TNFα對(duì)于肝纖維化的診斷敏感度和特異度良好。因此檢測(cè)IL-6、TNFα水平對(duì)于診斷肝纖維化可提供一定的參考信息。此外，隨著肝纖維化程度的加重，AE患者血清IL-6、TNFα水平明顯升高，其中肝纖維化F4級(jí)升高最明顯。說(shuō)明血清巨噬細(xì)胞極化相關(guān)因子與肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展都有一定關(guān)聯(lián)，但是其因果關(guān)系尚不能明確。

綜上，肝AE患者普遍存在巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)，且巨噬細(xì)胞極化相關(guān)因子IL-6、TNFα、TGFβ1水平與肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，對(duì)于預(yù)測(cè)肝纖維化的發(fā)生可提供一定的參考信息。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：鄂維建負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫(xiě)論文；王志鑫、祁秉民、龐明泉、張靈強(qiáng)、樊海寧參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；鄂維建、蘆永良擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。