郭雪健，李彬春，趙 邑，尉敬濤，張立偉

1山西大學分子科學研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室；2山西省生物研究院；3山西大學生物技術研究所，太原 030006

連翹脂素，主要存在于中藥連翹、桂花、小白菊及石榴籽中。近年來，人們發(fā)現(xiàn)連翹脂素具有多種藥理活性，如抗炎活性[1]、抑制人肺癌細胞株增殖[2]、抑制胰腺癌細胞的增殖和遷移[3]、調(diào)節(jié)自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓和舒張壓[4]等。連翹脂素是連翹苷脫糖后的苷元(見圖1)，Quan[5]、Mao等[6]研究發(fā)現(xiàn)連翹脂素在抗炎及抗癌效果上優(yōu)于連翹苷，此外，Ye等[7]發(fā)現(xiàn)連翹脂素的生物利用度較連翹苷高。目前，連翹脂素的制備方法主要有兩種：直接從植物中提取和經(jīng)由連翹苷轉(zhuǎn)化獲得。Wang等采用發(fā)酵連翹葉的方式制備獲得連翹脂素[8]。Mei等[9]從土壤中篩選得到一株具有轉(zhuǎn)化連翹苷生成連翹脂素的霉菌，還有使用纖維素酶或酸水解連翹苷制備連翹脂素[10]。但以上方法都存在一些缺陷，如酶的加入易造成乳化現(xiàn)象使產(chǎn)物難以分離制備；酸和霉菌可造成連翹脂素不穩(wěn)定產(chǎn)生副產(chǎn)物?；谝陨显颍壳斑€沒有一種簡單易行、完整可靠的轉(zhuǎn)化方法，需進一步完善。

圖1 連翹苷及連翹脂素結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of phillyrin and phillygenin

有報道稱連翹苷與人的腸道菌共孵育后會代謝產(chǎn)生連翹脂素。并且，連翹脂素可進一步代謝為小分子物質(zhì)[11]。因此，本研究希望從人源腸道菌中篩選出可以高效轉(zhuǎn)化連翹苷制備連翹脂素的菌，以彌補現(xiàn)有方法的不足，旨在為連翹脂素的進一步開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

GAM液體培養(yǎng)基、GAM固體培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒(北京Solarbio生物科技有限公司)；連翹苷(批號：MUST-18020210)、連翹脂素(批號：MUST-18072402)(成都曼思特生物科技有限公司)；色譜甲醇(Fisher Scientific 上海公司)。

ACQUITY H-class UPLC(美國 Waters 公司)；ionexUltiMate 3000超高效液相色譜及四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀、Xcalibur工作站(美國Thermo Fisher Scientific公司)；LAI-3T 厭氧培養(yǎng)箱(上海龍躍儀器設備有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 菌株篩選

1.2.1 腸道菌混懸液與培養(yǎng)基的制備

取健康成人的4 g中段糞便，立即溶于20 mL冰浴生理鹽水中，攪拌均勻后經(jīng)三層紗布過濾取上清，即為腸道菌混菌液[12]。

配置GAM液體培養(yǎng)基，滅菌后加入連翹苷至終濃度為0.5 mg/mL。藥物空白的GAM培養(yǎng)基為同法配置，但不含連翹苷。

1.2.2 菌株初篩

菌株初篩的主要目的是確定混菌液中含有轉(zhuǎn)化連翹苷的菌株，并利用連翹苷的抗菌作用縮小菌株篩選范圍[13]。具體方法為：量取4 mL含底物的GAM液體培養(yǎng)基于5 mL離心管中，加入腸道菌混懸液1 mL，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后取出。吸取1 mL轉(zhuǎn)化液加入4 mL甲醇，離心去除蛋白，將上清液減壓蒸干后，用2 mL乙酸乙酯溶解提取三次，過濾，合并溶解液減壓蒸干，然后用1 mL甲醇復溶，過0.22 μm濾膜、UPLC分析。同時做菌液空白及底物空白，各樣平行3份。

1.2.3 菌株復篩及純化

取“1.2.2”中轉(zhuǎn)化液，配制濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌液。取100 μL涂布平板，于37 ℃下厭氧培養(yǎng)后挑取平板中形態(tài)及顏色不同的單菌落，于試管中劃線培養(yǎng)再純化，至同一試管中長出的菌落形態(tài)及顏色均相同，獲得純化的單克隆菌株。取9 mL GAM液體培養(yǎng)基于10 mL帶蓋EP管中，將單菌株擴增培養(yǎng)至OD600值為0.7～0.8。

1.2.4 轉(zhuǎn)化模型的建立

主要采用Guo等[14]建立的人腸內(nèi)菌體外轉(zhuǎn)化模型，并略有修改。取4 mL含底物的GAM液體培養(yǎng)基于5 mL帶蓋EP管中，加入1 mL擴增的菌液，平行制備11份培養(yǎng)。分別于0、1、3、5、7、9、11、13、15、25、35 h取出一管。吸取1 mL加入2 mL甲醇中淬滅，并離心去除蛋白后按“1.2.2”中方法溶解轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析。單菌株保存于終濃度為20%甘油中，置于-80 ℃冰箱保存。

UPLC色譜分析條件：使用Waters ACQUITY H-class型超高效液相色譜儀(UPLC)，ACQUITY-UPLC-BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1×100 mm)。流動相為乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B)。梯度洗脫(0～4 min：10%→23%A；4～9.5 min：23%→23%A；9.5～11 min：23%→30%A；11～15 min：30%→40%A；15～17 min：40%→10%A；17～18 min：10%A)。流速0.3 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫40 ℃，進樣量2 μL。

標準曲線的繪制：以甲醇為溶劑配制濃度分別為0.01、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的連翹苷對照品溶液，進行UPLC分析，繪制標準曲線。同法繪制連翹脂素對照品溶液標準曲線。

1.2.5 轉(zhuǎn)化模型的方法學驗證

1.2.5.1 精密度考察

日內(nèi)精密度為在同一天內(nèi)將連翹苷和連翹脂素對照品溶液各濃度的樣品連續(xù)測定6次。根據(jù)標準曲線計算濃度和連續(xù)6次進樣的相對標準偏差(RSD)和準確度(RE)[14]。日間精密度為將各濃度的同一樣品連續(xù)進樣3天，每天進樣2次。

1.2.5.2 基質(zhì)效應和回收率試驗

按“1.2.2”中方法除去GAM培養(yǎng)基中的蛋白，再用其分別配制不同濃度的連翹苷和連翹脂素溶液，每個濃度平行6份，得到樣品A。然后，用甲醇代替除去蛋白的GAM培養(yǎng)基，同法配制，得到樣品B[14]。另用GAM培養(yǎng)基配制連翹苷和連翹脂素溶液，除去蛋白得到同樣濃度的樣品C。分別分析A、B和C，計算連翹苷和連翹脂素的濃度[14]，按照A/B×100%和C/A×100%計算基質(zhì)效應和回收率。

1.2.5.3 重復性考察

用GAM培養(yǎng)基配制3個不同濃度的連翹苷和連翹脂素溶液，每個濃度6份，除去蛋白得供試品溶液[14]。

1.2.6 液質(zhì)聯(lián)用對產(chǎn)物鑒定

采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)的方法，將連翹苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與標準品比對保留時間、一級碎片和二級碎片來鑒定產(chǎn)物。

質(zhì)譜參數(shù)為：離子源以電噴霧離子源(ESI)離子化方式；掃描模式：full scan/dd-MS2，正負離子切換并同時采集模式；正離子模式噴霧電壓為3.5 kV，負離子為2.5 kV；質(zhì)核比采集范圍100～1000；毛細管溫度320 ℃；鞘氣體積流量35 arb，輔助氣體積流量10 arb；加熱器溫度300 ℃；碰撞量設定為12.5、25和37.5 eV；分辨率設定為MS full scan 35000 FWHM以及MS/MS 17500 FWHM[15]。

1.2.7 菌株鑒定

觀察包括液體培養(yǎng)與平板培養(yǎng)后的菌株，并用革蘭氏染色法染色后進行顯微觀察。

16S rDNA測序分析：本部分16S rDNA測序工作交由華大基因科技有限公司武漢分公司完成。利用Premier 5.0軟件設計細菌的擴增引物得27f：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。然后提取目的基因后擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，上機測序。將所得序列提交NCBI網(wǎng)站在線Blast分析序列的同源性，并與數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.8 菌株轉(zhuǎn)化的氧氣條件考察

大腸桿菌SXUXJ-1為革蘭氏陰性兼性厭氧菌，為了提高后續(xù)實驗操作的簡便性，需要對其轉(zhuǎn)化條件的需氧性進行探究。在“1.2.4”的基礎上只改變厭氧培養(yǎng)為普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其余條件均不改變，同時做厭氧培養(yǎng)對照。

1.3 菌株的固定化

1.3.1 固定化菌球的制備

取9 mL不同濃度的海藻酸鈉溶液，加入菌液1 mL(平板菌落計數(shù)法[16]測得活菌數(shù)為3×1011～4×1011CFU/mL)，攪拌均勻后使用1 mL的注射器吸取溶液，在距離氯化鈣溶液液面垂直距離為10～15 cm處，將海藻酸鈉溶液勻速滴入氯化鈣溶液中，邊滴入邊勻速搖動。靜置交聯(lián)后濾出菌球，用滅菌的生理鹽水沖洗菌球3遍后備用。然后進行單因素條件探究，分別考察海藻酸鈉濃度、氯化鈣溶液濃度、交聯(lián)時間對菌球比活力的影響。最后，通過正交實驗優(yōu)化制備條件。

1.3.2 固定化菌球的酶活檢測

對硝基苯酚(p-nitrophenol，pNP)標準曲線繪制：配制濃度分別為30.3、60.6、121.2、151.5、242.4、303、484.8、606 μmol/L的pNP溶液。吸取100 μL的pNP溶液加入100 μL的Na2CO3溶液混合均勻，然后取100 μL于96孔板中，用酶標儀在400 nm處測吸光度，以pNP濃度(μmol/L)為橫坐標，以OD400為縱坐標繪制標準曲線。

固定化菌球酶比活力的檢測參照文獻[17]稍作修改：取5 g菌球放入5 mmol/L的pNPG(對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)溶液中，于37 ℃下誘導產(chǎn)酶1 h后濾出固定化的菌球，沖洗3遍。然后將菌球放入10 mL濃度為5 mmol/L的pNPG溶液中，置于37 ℃的搖床中以150 rpm反應1 h。取初加入菌球時(空白)和反應結(jié)束時的pNPG溶液各100 μL分別測吸光度，每組3平行。β-葡萄糖苷酶酶比活力計算公式如下：

公式中，比活力的單位為U/g；ΔC：pNP摩爾濃度差(mmol/L)；V：pNPG溶液體積(mL)；t：反應時間(h)；m：菌球質(zhì)量(g)。

固定化菌球酶活大小以β-葡萄糖苷酶酶活力大小評價，一個酶活單位(U)定義為：在上述反應條件下，每小時釋放1 μmol的pNP所需要的固定化菌球量。

1.3.3 固定化菌球轉(zhuǎn)化連翹苷研究

配置10 mL的連翹苷生理鹽水溶液，調(diào)整pH值后超聲15 min。取5 g菌球放入溶液中，在不同溫度的恒溫振蕩箱中以150 rpm轉(zhuǎn)化20 h后取出。向體系中加入30 mL甲醇終止反應，并超聲提取15 min。按“1.2.2”中方法溶解產(chǎn)物并計算連翹苷的轉(zhuǎn)化率，平行重復3次。分別考察pH值、溫度和底物濃度的對轉(zhuǎn)化率的影響。

菌球的耐用性考察：根據(jù)單因素確定的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件將同一批菌球連續(xù)使用14天，每天使用一次，觀察連翹苷轉(zhuǎn)化率的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 連翹苷、連翹脂素標準曲線

連翹苷標準曲線符合線性回歸方程y=4 156 129x+36 654，相關系數(shù)R2為0.999 2，線性范圍為0.01～1 mg/mL；連翹脂素標準曲線符合線性回歸方程y=6 163 326x+83 565，相關系數(shù)R2=0.999 0，線性范圍為0.01～1 mg/mL。式中y為峰面積，x為標準品濃度(mg/mL)。

2.2 方法學驗證結(jié)果

如表1所示，連翹苷和連翹脂素的RSD和RE均符合要求，該方法的日內(nèi)、日間精密度和準確度良好。如表2所示，連翹苷和連翹脂素的基質(zhì)效應和回收率的誤差都在±5%以內(nèi)，并且重復性的RSD在2%以內(nèi)，表明模型可靠可以用于后續(xù)轉(zhuǎn)化研究。

表1 精密度、準確度考察結(jié)果(n=6)

表2 基質(zhì)效應、回收率和重復性考察結(jié)果

2.3 菌株篩選結(jié)果

篩選純化后獲得了一株具有較強的連翹苷轉(zhuǎn)化能力的單菌株，命名為SXUXJ-1。圖2為該菌株的平板生長圖。

圖2 菌株SXUXJ-1在平板上生長圖Fig.2 The growth of strain SXUXJ-1 on the plate

圖3反應了菌體在培養(yǎng)開始后5 h進入對數(shù)生長期，同時開始轉(zhuǎn)化連翹苷；15 h后進入穩(wěn)定期，此時連翹苷已基本轉(zhuǎn)化完全。反應持續(xù)20 h后，產(chǎn)物連翹脂素的量基本保持不變。

圖3 菌株(SXUXJ-1)生長曲線及轉(zhuǎn)化連翹苷的時效曲線Fig.3 The growth curve and the time-activity curve of transforming phillyrin of strain (SXUXJ-1)

從圖4中可以看出，連翹苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的液相保留時間與連翹脂素對照品一致。

2.4 產(chǎn)物UPLC-MS分析結(jié)果

在正離子模式下，比較產(chǎn)物與標品相對豐度最高(依次為355.15、373.16、390.19、189.09、395.15)的五個分子離子峰保持一致。推測其中質(zhì)核比為355.15的碎片為連翹脂素中性損失水而產(chǎn)生。比較其二級質(zhì)譜圖，相對豐度最高的五個碎片分別為337.14、355.15、284.10、137.06、286.11。以上五個碎片在產(chǎn)物與標準品中均保持一致。

結(jié)合圖4中樣品與標準品液相色譜保留時間的一致性，及連翹脂素的理論生成量與實際生成量無明顯差別，可以判斷產(chǎn)物為連翹脂素。并且在轉(zhuǎn)化體系中，連翹脂素生成后可以在20 h內(nèi)保持穩(wěn)定，無副產(chǎn)物生成。

圖4 菌株SXUXJ-1轉(zhuǎn)化連翹苷液相色譜圖Fig.4 Liquid chromatographic image of phillyrin transformed by strain SXUXJ-1注：A為菌液空白組；B為實驗組12 h；C實驗組轉(zhuǎn)化結(jié)束；D為混標。Note:A:Bacterial liquid blank group;B:Experimental group 12 h;C:The end of transformation of experimental group;D:Mixed stand-ard solution.

2.5 菌株的鑒定結(jié)果

如圖5所示，經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下可觀察到菌株SXUXJ-1呈短桿狀，兩端圓頭。圖2所示平板上菌落為圓或近圓，邊緣整齊表面光滑，顏色為乳白色，培養(yǎng)24 h后菌落大小為2 mm，在有氧或無氧狀態(tài)均可生長。菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)基變渾濁，產(chǎn)生氣泡及沉淀。革蘭氏染色結(jié)果為陰性。

圖5 菌體顯微形態(tài)Fig.5 Micromorphology of the strain

16S rDNA測序結(jié)果經(jīng)拼接，得到菌株SXUXJ-1的16S rDNA序列，長度為1 409 bp，序列如下：

將測序所得序列與NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫進行blast同源序列分析。通過繪制菌株系統(tǒng)進化樹(圖6)發(fā)現(xiàn)，菌株SXUXJ-1與埃希氏屬大腸桿菌(Escherichiacoli)的多個菌株具有較高的同源性，與登錄號為CCFM8336及KVP104的大腸桿菌菌株具有99.86%的相似度，序列比對覆蓋率達100%。參考《伯杰氏細菌手冊》第八版相關內(nèi)容及測序結(jié)果，綜合該菌株的形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果，可以確定菌株SXUXJ-1為腸桿菌科埃希氏屬大腸桿菌，已保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號：CGMCC No:21514。

圖6 菌株SXUXJ-1 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of SXUXJ-1 based on 16S rDNA

2.6 有氧與厭氧培養(yǎng)對比

有氧及厭氧培養(yǎng)條件下連翹脂素的最終得率分別為96.9%和96.0%。結(jié)合表3，可以看出是否提供厭氧培養(yǎng)條件對連翹苷轉(zhuǎn)化率與連翹脂素轉(zhuǎn)化得率無明顯影響。在后續(xù)轉(zhuǎn)化中無需提供嚴格厭氧條件，這樣可以減少成本及降低操作復雜性。

表3 有氧及厭氧培養(yǎng)對比

2.7 菌株的固定化條件

對硝基苯酚標準曲線符合線性回歸方程y=0.002 075x+0.050 51，相關系數(shù)R2=0.998 7，線性范圍0～606 μmol/L，式中y為吸光度，x為對硝基苯酚濃度。

圖7 單因素考察結(jié)果Fig.7 Results of single factor investigation

根據(jù)圖7單因素結(jié)果確定的最佳條件為海藻酸鈉濃度2.5%、CaCl2濃度3.5%、交聯(lián)時間3 h。則正交實驗因素水平設置為：A海藻酸鈉濃度2、2.5、3%；B氯化鈣濃度3、3.5、4%；C交聯(lián)時間1、3、5 h。

通過極差分析可知(見表4)，3個因素對酶活影響的大小順序為：A>C>B，即海藻酸鈉濃度>交聯(lián)時間>氯化鈣濃度。

表4 正交實驗結(jié)果

正交分析的效應曲線給出固定化菌球工藝條件為海藻酸鈉濃度為3%，氯化鈣濃度為3.5%，交聯(lián)時間3 h，以此工藝條件制作的凝膠球如圖8所示，膠球大小適中，機械強度較好。

圖8 海藻酸鈉凝膠球Fig.8 Sodium alginate hydrogel beads

根據(jù)最優(yōu)條件重復三次驗證得到酶活平均為0.836 U，標準差(SD)為0.013 3，相對標準偏差(RSD)為1.6%。

在pH值條件考察中，pH值為8時連翹苷的轉(zhuǎn)化率達到最大82.5%，說明此時菌體活力旺盛，轉(zhuǎn)化效率最高，因此確定pH值8為最適條件。

當?shù)孜餄舛戎饾u增大時，由于連翹苷具有一定的抗菌作用，濃度過大必然會在一定程度上影響微生物生存，同時也會超過菌的催化能力，則轉(zhuǎn)化效率較低，經(jīng)濟性不高；而如果底物濃度過小時，又不利于充分發(fā)揮菌球效力。因此，菌球與底物濃度之間存在一個最佳比例。從圖9中可以看出，當?shù)孜餄舛葟?.2～0.8 mg/mL逐步增大時，連翹苷的轉(zhuǎn)化率下降緩慢。這可能是由于菌球提供的酶量較為充足，底物可以與酶充分接觸。而當?shù)孜餄舛雀哂?.8 mg/mL后，連翹苷的轉(zhuǎn)化率急劇下降，這可能是因為底物量超過了體系中酶的最大催化能力，而使連翹苷的轉(zhuǎn)化率下降。因此綜合考慮轉(zhuǎn)化率以及經(jīng)濟性，選擇底物濃度為0.8 mg/mL。

圖9 單因素條件轉(zhuǎn)化條件考察Fig.9 Investigation on single-factor condition transformation process

2.8 轉(zhuǎn)化條件考察結(jié)果

腸桿菌科的細菌一般最適溫度在33～42 ℃，因此本研究選擇考察范圍為30～45 ℃。如圖9所示，當溫度為39 ℃時，連翹苷轉(zhuǎn)化率最大，即選擇39 ℃為最優(yōu)轉(zhuǎn)化溫度。

綜上，確定固定化菌球轉(zhuǎn)化連翹苷的條件為pH值為8，底物濃度為0.8 mg/mL，溫度為39 ℃。在此條件下重復三次，得到連翹苷在20 h內(nèi)的轉(zhuǎn)化率分別為84.3%、85.7%、85.6%，平均轉(zhuǎn)化率達到85.2%，將轉(zhuǎn)化時間延長至25 h左右，連翹苷即可實現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化；計算連翹脂素的最終得率分別為96.8%、97.2%、96.9%，平均得率為97.0%。

2.9 菌球的耐用性

圖10所示固定化菌球連續(xù)循環(huán)使用13次后，連翹苷在20 h內(nèi)的轉(zhuǎn)化率仍能達到70.2%。說明在此工藝條件下，微生物經(jīng)固定化后可以維持其生命活力，連續(xù)產(chǎn)生酶，菌球具有良好的耐用性。

圖10 菌球的耐用性Fig.10 Durability of the bacteria ball

3 討論與結(jié)論

首先在篩菌研究中，由于連翹苷具有一定的抗菌作用，我們在初篩所用的液體培養(yǎng)基及復篩所用的平板培養(yǎng)基中均加入一定量的連翹苷，可以抑制與連翹苷不友好的菌株生長，為篩選縮小了一定的范圍。其次，已有研究表明，連翹苷在腸道菌的作用下轉(zhuǎn)化為連翹脂素后會繼續(xù)代謝產(chǎn)生副產(chǎn)物[11]。本研究篩選得到的單菌株在轉(zhuǎn)化連翹苷得到連翹脂素后，產(chǎn)物可在20 h內(nèi)保持穩(wěn)定，未發(fā)生繼續(xù)代謝，無副產(chǎn)物的生成。本方法克服了已有微生物轉(zhuǎn)化法中連翹脂素繼續(xù)被代謝的缺點，也未引入多余基團。再次，大腸桿菌是一種革蘭氏陰性兼性厭氧菌，由于其良好的生長活力及可有效利用廉價碳源，在基因工程中被改造為工程菌。其兼性厭氧的特點對于發(fā)酵工程上具有重要的意義，本研究篩選到的大腸桿菌同時具備以上特性。最后，我們還使用固定化微生物的方法將菌株SXUXJ-1固定，通過優(yōu)化制作工藝最終制得了一種實用性較強的菌球。在最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件下，連翹苷可在25 h左右轉(zhuǎn)化完全。固定化菌球轉(zhuǎn)化法是一種簡單、高效、環(huán)保的方法，且轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物連翹脂素易于提取分離，因此具備非常好的應用前景。