朱永紅，范震宇，韓 勇，吳雯儀，蔡亮亮*

1南通大學附屬醫(yī)院藥學部；2南通大學附屬醫(yī)院腫瘤科；3國藥控股南通有限公司，南通 226001

多糖的活性通常與糖單元的組成、分子量、糖苷鍵的類型、主鏈構(gòu)型、支鏈、空間構(gòu)型相關(guān)，結(jié)構(gòu)修飾后的多糖與原多糖相比，水溶性會明顯提高，有利于多糖活性的增強，有些甚至會產(chǎn)生新的生物活性。磷酸化、硫酸酯化、羧甲基化和乙?；浅Ｓ玫亩嗵腔瘜W修飾方法，其中硫酸酯化多糖因其具有良好的生物活性，如抗凝血、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、增強機體免疫力等[1-5]，引起越來越多研究人員的關(guān)注。多糖的硫酸酯化是指多糖分子鏈上的羥基被硫酸基團取代而發(fā)生的反應(yīng)，反應(yīng)所得的產(chǎn)物又稱多糖硫酸酯[6]。多糖硫酸酯化常用的方法主要有氯磺酸-吡啶法、濃硫酸法、Nagasawa法等[7]。其中氯磺酸-吡啶法具有反應(yīng)試劑經(jīng)濟、反應(yīng)條件簡單、產(chǎn)物回收率高等優(yōu)點，因此常作為多糖硫酸酯化的方法。

蒲公英根為菊科植物蒲公英的干燥根，具有抗氧化、降血脂、保肝等多種藥理活性[8-10]。馬紅梅等的研究表明多糖是蒲公英根中含量最高的活性成分，其含量可達42.75%[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)蒲公英根多糖具有較好的體外抗氧化活性，體現(xiàn)在對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基均有較好的清除能力，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系[12]。但是我們在研究中發(fā)現(xiàn)蒲公英根多糖水溶性不是很好，限制其發(fā)揮更好的藥效。文獻報道多糖硫酸酯化可以提高多糖的水溶性，增強其生物活性[13]。因此，作者考慮對蒲公英根多糖進行硫酸酯化修飾。H2O2是一種常見的活性氧分子，可通過破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)，尤其是基因組與線粒體中的DNA，誘導(dǎo)細胞凋亡或壞死[14]。由于H2O2能夠有效提高細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，模擬機體內(nèi)的氧自由基的損傷情況，因而常被用于建立體外細胞氧化應(yīng)激損傷的模型物質(zhì)[15]。因此，本研究擬采用H2O2造細胞氧化應(yīng)激損傷模型，考察硫酸酯化蒲公英根多糖對H2O2誘導(dǎo)細胞損傷的保護作用。

綜上，本研究采用氯磺酸-吡啶法對蒲公英根多糖進行硫酸酯化修飾，以取代度為指標，用響應(yīng)曲面法對硫酸酯化的工藝進行優(yōu)化，初步探討蒲公英根多糖及其硫酸酯對H2O2誘導(dǎo)致HepaRG細胞氧化損傷的保護作用，以期為蒲公英根多糖的開發(fā)利用提供有價值的參考。

1 材料

1.1 實驗材料

HepaRG細胞(上海冠導(dǎo)生物科技有限公司)；蒲公英根(吉林省鼎祥參業(yè)有限公司)，蒲公英(吉林)。

1.2 試劑

MTT(批號：73020200812，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；吡啶(批號：20150416，上海凌峰化學試劑有限公司)；二甲基亞砜(批號：20150818，上海凌峰化學試劑有限公司)；氯磺酸(批號：C1276，山東西亞化學試劑有限公司)；二甲基甲酰胺(批號：20190424，國藥集團化學試劑有限公司)；酚酞(批號：20151222，國藥集團化學試劑有限公司)；氫氧化鈉(批號：20181221，國藥集團化學試劑有限公司)；硫酸鉀(批號：20190507，國藥集團化學試劑有限公司)；氯化鋇(批號：151015，西隴化工股份有限公司)；鹽酸(批號：150120044H，南京化學試劑有限公司)；1640培養(yǎng)基(批號：8121248，美國Gibco公司)；胰蛋白酶(批號：2186974，美國Gibco公司)；胎牛血清(批號：2177358，美國Gibco公司)。

1.3 儀器

H03-A數(shù)顯磁力攪拌器(上海梅穎浦)；HWS-24恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)；IX53熒光倒置顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；TENSOR 27傅立葉變換紅外光譜儀(德國布魯克公司)；MK-3酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司)；Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 蒲公英根多糖的制備

取蒲公英根適量，用蒸餾水洗凈，70 ℃下烘干，然后將干燥的蒲公英根磨成粉末。稱取一定量藥材粉末，用95%乙醇回流提取2次，每次2 h，趁熱抽濾，取濾渣，烘干備用；精密稱取濾渣約20 g，加入500 mL蒸餾水，回流提取2次，每次4 h，合并2次的提取液，離心(4 000 rpm)15 min，收集上清液，上清液減壓濃縮至適量體積，然后加入4倍體積的無水乙醇沉淀，4 ℃靜置過夜，Sevag法除蛋白，樣品溶液用透析袋(透析分子量3 500 Da)流水透析48 h，收集透析液并濃酸縮至適量體積，冷凍干燥得蒲公英根多糖。另取2份濾渣約20 g，按照上述提取工藝提取多糖,計算蒲公英根多糖的得率，多糖得率=(多糖質(zhì)量/藥材質(zhì)量)×100%。

2.2 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定蒲公英根多糖的含量。精密稱取葡萄糖對照品10 mg，用蒸餾水溶解配制成約100 μg/mL的對照品溶液。精密量取不同體積(0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.8 mL)的葡萄糖對照品溶液分別置于6個具塞試管中，補加蒸餾水至1 mL，搖勻。另取1 mL蒸餾水置具塞試管中，作為空白對照。每支試管中分別加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，充分搖勻，90 ℃下反應(yīng)30 min，室溫冷卻30 min。于490 nm波長處測定吸光度。蒲公英根多糖按照上述方法測定吸光度，計算多糖含量。

2.3 多糖硫酸酯化工藝研究

2.3.1 硫酸酯化試劑的配制

此反應(yīng)需嚴格無水，首先用無水硫酸鈉對吡啶脫水，制得無水吡啶。取適量體積的無水吡啶置于燒瓶中，冰浴下攪拌10 min，另取適量體積的氯磺酸，緩慢加入，并不斷攪拌，室溫下反應(yīng)30 min，制得硫酸酯化試劑，4 ℃保存?zhèn)溆谩⒄丈鲜龇椒ㄖ苽洳煌拎?氯磺酸體積比(2、4、6、8、10)的酯化試劑。

2.3.2 硫酸酯化反應(yīng)

取0.2 g蒲公英根多糖置于燒瓶中，加入60 mL無水二甲基甲酰胺(DMF)，攪拌使其溶解。逐滴加入已經(jīng)制備好的酯化試劑，加完后調(diào)節(jié)至適當溫度，反應(yīng)一段時間，反應(yīng)完成后，恢復(fù)至室溫，用20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性，自來水透析1天，蒸餾水透析2天。透析液濃縮，冷凍干燥得硫酸酯化蒲公英根多糖。

2.3.3 單因素試驗

2.3.3.1 反應(yīng)溫度對蒲公英根多糖硫酸酯化的影響

精密稱取0.2 g蒲公英根多糖，置于燒瓶中，用60 mL無水二甲基甲酰胺攪拌使其溶解，平行配制5份樣品溶液。分別逐滴加入15 mL酯化試劑(吡啶∶氯磺酸=6)，加完后調(diào)節(jié)至不同溫度(50、60、70、80、90 ℃)，反應(yīng)3 h，反應(yīng)完成后，調(diào)pH至中性，透析，冷凍干燥?？疾旆磻?yīng)溫度對蒲公英根多糖硫酸酯化的影響。

2.3.3.2 吡啶與氯磺酸比對蒲公英根多糖硫酸酯化的影響

精密稱取0.2 g蒲公英根多糖，置于燒瓶中，用60 mL無水二甲基甲酰胺攪拌使其溶解，平行制備5份樣品。分別逐滴加入吡啶與氯磺酸的不同比例(2、4、6、8、10)制備的酯化試劑15 mL，加完后調(diào)節(jié)溫度至80 ℃，反應(yīng)3 h，反應(yīng)完成后，調(diào)pH至中性，透析，冷凍干燥。考察吡啶與氯磺酸比對蒲公英根多糖硫酸酯化的影響。

2.3.3.3 反應(yīng)時間對蒲公英根多糖硫酸酯化的影響

精密稱取0.2 g蒲公英根多糖，置于燒瓶中，用60 mL無水二甲基甲酰胺攪拌使其溶解，平行配制5 份樣品溶液，分別逐滴加入15 mL酯化試劑(吡啶∶氯磺酸=6)，加完后調(diào)節(jié)溫度至80 ℃，分別反應(yīng)不同時間(1、2、3、4、5 h)，反應(yīng)完成后，調(diào)pH至中性，透析，冷凍干燥?？疾旆磻?yīng)時間對蒲公英根多糖硫酸酯化的影響。

2.3.4 響應(yīng)曲面實驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，每個單因素選擇取代度較高的三個水平，以反應(yīng)溫度、吡啶與氯磺酸比、反應(yīng)時間為自變量，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗。實驗因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表

2.3.5 取代度測定

2.3.5.1 溶液配制

明膠溶液：精密稱取明膠2 g，溶于400 mL蒸餾水中，4 ℃保存?zhèn)溆?；氯化鋇-明膠溶液：稱取氯化鋇10 g溶于100 mL明膠溶液中，4 ℃保存?zhèn)溆茫涣蛩徕浫芤旱呐渲疲壕芊Q取硫酸鉀0.362 g，置于500 mL量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.4 mg/mL SO42-工作液，備用；0.2 mol/L鹽酸的配制：精密量取9 mL鹽酸置500 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。

2.3.5.2 標準曲線的繪制

參考文獻[16]的方法作輕微的修改，精密量取標準K2SO4溶液(0.4 mg/mL)0、0.5、1、2、3、5、7、9 mL，分別置于50 mL量瓶中，加水補足至10 mL。然后依次加入0.2 mol/L的鹽酸溶液10 mL，明膠溶液1 mL，充分振蕩混勻，再加入2.0 mL的氯化鋇-明膠溶液，渦旋混勻。室溫下反應(yīng)20 min，用紫外分光光度計在360 nm波長處測得吸光度值記為A1?？瞻自囈旱奈舛戎涤洖锳2，以硫酸根的濃度為橫坐標，(A1-A2)吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

2.3.5.3 樣品硫酸酯化取代度測定

精密稱取硫酸酯化蒲公英根多糖20 mg，加入20 mL鹽酸溶液(1 mol/L)，沸水浴中水解6 h，使硫酸根離子游離。取5 mL樣品溶液同標準曲線項下方法分析，測量氯化鋇-明膠與明膠的吸光度差值。然后代入以下方程，計算取代度(degree of substitution，DS)，DS=1.62S/(32-1.02S)，S是樣品中硫元素的百分率。

2.3.6 紅外光譜分析

取硫酸酯化蒲公英根多糖約2 mg，與400 mg溴化鉀研磨壓片，于4 000～400 cm-1進行紅外檢測。

2.4 蒲公英根多糖及其硫酸酯的細胞毒性試驗

取對數(shù)生長期的HepaRG細胞，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，將HepaRG細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。對照組更換新鮮培養(yǎng)基，其他組棄去原培養(yǎng)基，加入含有不同濃度(31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL)的蒲公英根多糖、硫酸酯化蒲公英根多糖。每組設(shè)8個復(fù)孔，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液(1 mg/mL)100 μL，孵育4 h，吸凈MTT溶液，棄上清，每孔加150 μL DMSO溶液，振蕩 10 min，用酶標儀于490 nm處檢測。細胞存活率計算公式如下：存活率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

2.5 蒲公英根多糖及其硫酸酯對HepaRG細胞氧化損傷的保護作用

取對數(shù)生長期的HepaRG細胞，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，將HepaRG細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。H2O2造模濃度參考文獻[17]，選擇300 μmol/L。細胞分為對照組，H2O2模型組、蒲公英根多糖組、硫酸酯化蒲公英根多糖組。對照組、模型組更換培養(yǎng)液，蒲公英根多糖組、硫酸酯化蒲公英根多糖組更換不同濃度(31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL)的溶液，預(yù)處理24 h。吸去96孔板中的培養(yǎng)液，除對照組更換培養(yǎng)液，其他各組更換300 μmol/L H2O2溶液預(yù)處理8 h，棄去上清，每孔加入MTT溶液(1 mg/mL)100 μL，實驗設(shè)8個復(fù)孔，孵育4 h，吸凈MTT溶液，棄上清，每孔加150 μL DMSO溶液，振蕩10 min，用酶標儀于490 nm處檢測。細胞存活率計算同上。

3 結(jié)果與討論

3.1 多糖含量與提取率

以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程為y= 0.057x+0.035，r= 0.999 2。根據(jù)標準曲線方程計算出蒲公英根多糖含量為85.2%。蒲公英根多糖的提取率為43.86%±0.65%。

3.2 單因素試驗結(jié)果

3.2.1 反應(yīng)溫度對蒲公英根多糖硫酸酯化的影響

結(jié)果見圖1a，在50～80 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的升高，硫酸酯化蒲公英根多糖取代度明顯增加。80～90 ℃時，隨著溫度的升高，多糖硫酸基取代度反而有稍許降低，這可能是多糖發(fā)生降解，產(chǎn)生副反應(yīng)的緣故。本實驗在80 ℃條件下，多糖的取代度最高。因此選擇80 ℃作為后續(xù)硫酸酯化反應(yīng)的溫度。

3.2.2 氯磺酸與吡啶的比對蒲公英根多糖硫酸酯化的影響

結(jié)果見圖1b，蒲公英根多糖硫酸基取代度隨吡啶用量的升高先增加后降低。多糖在吡啶溶液中溶解度較低，氯磺酸與吡啶能發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，提高多糖溶解度，使得多糖硫酸根取代度提高。本實驗在吡啶與氯磺酸的比為6條件下，多糖的取代度最高，因此選擇吡啶與氯磺酸的比為6作為后續(xù)硫酸酯化反應(yīng)的吡啶與氯磺酸的比。

3.2.3 反應(yīng)時間對蒲公英根多糖硫酸酯化的影響

結(jié)果見圖1c，反應(yīng)時間1～3 h，取代度由0.43增至1.05，增加趨勢明顯。這可能是多糖在此時間范圍內(nèi)，與硫酸酯化試劑不斷充分接觸的緣故。反應(yīng)時間3～5 h，取代度由1.05降至0.89，這是因為硫酸酯化反應(yīng)是可逆的，當達到反應(yīng)平衡時，多糖發(fā)生了降解，取代度因而有降低的趨勢。

圖1 單因素試驗結(jié)果Fig.1 The results of single factor tests

3.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

采用Box-Behnken 設(shè)計，以反應(yīng)溫度、吡啶與氯磺酸比、反應(yīng)時間為自變量，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗。試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得二元多項回歸方程：Y=1.06+0.055A+0.18B+0.06C+0.024AB+0.072AC-0.089BC-0.15A2-0.071B2-0.13C2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

由表3可知，模型的一次項反應(yīng)溫度(P=0.025 5<0.05)具有顯著性；吡啶與氯磺酸比(P<0.000 1)具有極顯著性；反應(yīng)時間(P=0.018 8<0.05)具有顯著性。交叉項中反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間(P=0.035 7<0.05)，吡啶與氯磺酸比與反應(yīng)時間(P=0.014 9<0.05)具有顯著性。二次項中反應(yīng)溫度(P=0.000 9<0.001)具有極顯著性；吡啶與氯磺酸比(P=0.033 6<0.05)具有顯著性；反應(yīng)時間(P=0.002 2<0.01)具有高度顯著性。整體模型的P=0.000 3，表明二次方程模型顯著，模型的失擬項P=0.357 6>0.05，說明模型顯著合適。

表3 回歸分析結(jié)果

續(xù)表3(Continued Tab.3)

響應(yīng)曲面及等高線分析蒲公英根多糖硫酸酯化的響應(yīng)面分析見圖2。等高線圖反映了影響多糖硫酸酯化的各因素的交互作用。橢圓形等高線表示各因素交互作用顯著，曲率半徑與交互作用呈正相關(guān)，半徑最大的橢圓上取值，取代度最小，半徑最小的橢圓上取值，取代度最大，這些等高線可以反映取代度的變化情況。響應(yīng)面的最高點同時也是等高線最小橢圓的中心點。各因素對多糖取代度的影響為：吡啶與氯磺酸比與反應(yīng)時間>反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間>反應(yīng)溫度與吡啶與氯磺酸比。

圖2 等高線圖及響應(yīng)面3D圖Fig.2 Contourplots and response surface 3D plots

由Design-Expert.8.0.6.1軟件分析，多糖硫酸酯化取代度最大為1.17，對應(yīng)的反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度82.56 ℃、吡啶與氯磺酸比為8、反應(yīng)時間2.96 h。為了試驗操作方便，將多糖的硫酸酯化反應(yīng)條件修正為反應(yīng)溫度83 ℃、吡啶與氯磺酸比為8、反應(yīng)時間3 h。按照此反應(yīng)條件重復(fù)3次，取代度分別為1.12、1.16、1.11，方法穩(wěn)定，平均取代度1.13，此方法可行。

3.4 取代度檢測

3.5 硫酸酯化蒲公英根多糖紅外光譜分析

硫酸酯化蒲公英根多糖的紅外光譜分析見圖3，在波長為3 530 cm-1有一個比較寬的振動吸收峰即-OH的伸縮振動吸收峰；2 967.1 cm-1吸收峰是-CH的伸縮振動吸收峰；在1 656.1 cm-1存在較強的吸收峰是羰基不對稱伸縮振動引起的；1 490、1 379.2 cm-1是-CH面內(nèi)彎曲振動引起的；1 261.5、1 242.3 cm-1由S=O不對稱振動引起；1 067.4、1 024.6、1 000.5 cm-1由C-O伸縮振動引起的；815.3 cm-1由對稱的C-O-S振動引起，說明多糖硫酸酯化修飾成功。

圖3 硫酸酯化多糖的紅外光譜圖Fig.3 Infraredspectrumof sulfated polysaccharide

3.6 蒲公英根多糖及硫酸酯的細胞毒性試驗

在評估蒲公英根多糖及硫酸酯對HepaRG細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用之前，采用MTT法考察多糖及硫酸酯對HepaRG細胞活力的影響，以確保其無細胞毒性。試驗結(jié)果見圖4a、4b。HepaRG細胞在含不同濃度(31.25～1 000 μg/mL)蒲公英根多糖及硫酸酯溶液中孵育24 h的細胞存活率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義；在濃度為2 000 μg/mL時，差異有統(tǒng)計學意義，但是各組的細胞存活率均大于90%，這表明蒲公英根多糖及硫酸酯具有良好的生物學活性，對HepaRG細胞無顯著的細胞毒性。

圖4 蒲公英根多糖及其硫酸酯對H2O2致HepaRG細胞損傷活力的影響Fig.4 Effects of dandelion root polysaccharide and its sulfate on H2O2 induced HepaRG cell injury注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note: Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with model group,#P<0.05,##P<0.01.

3.7 蒲公英根多糖及硫酸酯對HepaRG細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用

MTT測定結(jié)果見圖4c。模型組細胞存活率為(51.38±3.92)%。與模型組比較，蒲公英根多糖及其硫酸酯在濃度(31.25～250 μg/mL)范圍內(nèi)，HepaRG細胞存活率與濃度成劑量依賴性，在250 μg/mL時，HepaRG細胞存活率最高。濃度(500～2 000 μg/mL)范圍內(nèi)，HepaRG細胞存活率隨著濃度的增加，有降低的趨勢，這可能是較高濃度的多糖影響細胞膜內(nèi)滲透性。濃度31.25 μg/mL時，蒲公英根多糖及硫酸酯對H2O2損傷的HepaRG細胞保護無明顯差異。62.5～2 000 μg/mL濃度范圍內(nèi)，硫酸酯化蒲公英根多糖的活性優(yōu)于蒲公英根多糖。

氧化應(yīng)激是指細胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學衍生物而引起的細胞損傷，在代謝綜合征中起著重要作用，它是肥胖、糖尿病、脂質(zhì)沉積、慢性炎癥等發(fā)生、發(fā)展的重要因素。

H2O2作為活性氧在體內(nèi)的主要存在形式，其極易透過細胞膜對細胞造成損傷。在H2O2刺激下，細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，細胞DNA繼而受到損傷，相關(guān)基因的表達發(fā)生改變，進一步導(dǎo)致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的損傷，最終可以造成細胞死亡。蒲公英根多糖及其硫酸酯對H2O2致HepaRG細胞損傷具有保護作用，可能與其具有較好的抗氧化活性有關(guān)，這項研究可為蒲公英根多糖及其修飾物的開發(fā)應(yīng)用提供有價值的參考。

4 結(jié)論

本試驗采用氯磺酸-吡啶法對蒲公英根多糖進行硫酸酯化修飾，并用響應(yīng)曲面法對硫酸酯化的工藝進行優(yōu)化，得到硫酸酯化反應(yīng)的最優(yōu)條件為反應(yīng)溫度83 ℃、吡啶與氯磺酸比為8、反應(yīng)時間3 h，在此條件下，硫酸酯化蒲公英根多糖的取代度為1.13。經(jīng)過硫酸酯化修飾后的蒲公英根多糖對H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷細胞具有較好的保護作用。本研究表明，硫酸酯化修飾有助于提高蒲公英根多糖的抗氧化能力，為蒲公英根多糖的進一步開發(fā)利用提供新的思路與方向。