王丹丹，盧建璋，王 星

(1.遼東學院農(nóng)學院，遼寧 丹東 118003；2.浙江大學愛丁堡大學聯(lián)合學院，浙江 海寧 314499)

紅光熊蜂(BombusignitesSmith)是一類重要的傳粉昆蟲，具嚼吸式口器，吻喙長，接觸植物柱頭頻率高；除大顎可用作咀嚼或塑蠟外，中舌、小顎外葉和下唇須合并構成復雜的食物管，借以吸食花蜜.與蜜蜂相比，熊蜂沒有敏銳的信息交流系統(tǒng)，有利于植物的授粉[1]；此外，熊蜂訪花時間較長，抵御低溫、弱光、高濕等惡劣生態(tài)環(huán)境的能力較突出[2-4].熊蜂主要分布在我國遼寧、黑龍江、河北和云南等地，在設施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用面積有逐年上升趨勢.目前，各國已逐漸采用熊蜂授粉取代傳統(tǒng)的震動授粉和激素點花授粉，成為世界公認的綠色食品安全生產(chǎn)中的重要一環(huán)[5-6].

線粒體DNA(mtDNA)是獨立于動物細胞核外唯一擁有自身一套遺傳密碼子和蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)(線粒體蛋白質(zhì)的合成也在細胞質(zhì)中進行)的遺傳物質(zhì)[7].其中，由線粒體參與編碼的細胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase，Co)，是一種存在于細菌或線粒體上的大型跨膜蛋白復合物，為真核生物線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈上的終端酶，可以同時將4個細胞色素C的電子傳遞到一個氧分子上，還原為水，并合成ATP.真核細胞的細胞色素C氧化酶由13個亞基組成，其中CoI，CoII和CoIII基因為級聯(lián)反應核心最大的3個亞基，分別由mtDNA編碼，其余10個亞基均由細胞核DNA編碼[8].CoI基因具有更大的系統(tǒng)發(fā)生信號范疇，其通用引物可覆蓋大多數(shù)動物類群的5′端.因此，與核基因相比，CoI基因是藥物作用偏好的靶基因.[9]磷化氫是糧食儲備常用的高效熏蒸殺蟲劑，是牛心細胞色素C氧化酶的非競爭性抑制劑，由于磷化氫對細胞色素C氧化酶具有特殊的翻譯后修飾功能，阻斷其接受電子將氧分子還原為水，可能是導致熊蜂等授粉昆蟲致死的主要原因[10-13].本實驗采用RT-PCR和RACE技術對紅光熊蜂CoI基因進行了克隆、測序；采用DNAMAN，DNAstar和MEGA7.0等生物信息學軟件預測了紅光熊蜂CoI基因編碼的蛋白質(zhì)結構、功能和基本理化特性等，并基于氨基酸序列構建了紅光熊蜂系統(tǒng)進化樹，以為進一步研究紅光熊蜂等授粉昆蟲CoI基因的功能、明確分解周期較長的高毒性化學農(nóng)藥在熊蜂線粒體中的作用靶位點提供依據(jù)，為設計新型環(huán)保、無公害的殺蟲劑奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取繁育旺盛、健康無病的20日齡紅光熊蜂工蜂.紅光熊蜂工蜂由遼東學院農(nóng)學院蜜蜂研究所人工室內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為無光照、相對濕度50%±5%、溫度(28±0.5)℃.實驗于2018年7月至2019年10月于遼東學院農(nóng)學院基因工程實驗室完成.

1.2 總RNA的提取

將工蜂于液氮下研磨至粉末狀，4℃條件下迅速轉入無菌的eppendorf管中，加入1.5 mL Trizol液體，按照Takara公司總RNA微量提取試劑盒(Takara insect total RNA isolation kit)操作步驟提取總RNA.采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，-80℃保存，以備后續(xù)試驗.

1.3 紅光熊蜂CoI基因全長cDNA基因的獲得

1.3.1 紅光熊蜂CoI基因cDNA片段的合成

按照Primer-Script RT reagent Kit(Takaka，www.takara-bio.com)反轉錄試劑盒操作說明，以紅光熊蜂總RNA為模板，采用RT-PCR技術反轉錄生成cDNA第一鏈；下載NCBI數(shù)據(jù)庫中已登記的熊蜂CoI基因cDNA的部分已知序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計RT-PCR特異性引物(即CoI1)(見表1)，以已合成的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增.RT-PCR反應體系20 μL.cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，Taq 高分子混合物(Taq Master Mix)(2×) 13 μL，加滅菌ddH2O至20 μL.RT-PCR反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性40 s，58℃退火50 s，72℃延伸3 min，35個循環(huán)；72℃延伸8 min.RT-PCR擴增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段，回收后將片段與克隆載體pMD-19T連接，連接體系20 μL：1 μL T4連接酶、1 μL pMD-19T克隆載體，膠回收產(chǎn)物16 μL、T4連接酶Buffer 2 μL，16℃過夜連接；連接產(chǎn)物轉化于大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，37℃孵育1 h，采用藍白篩選法篩選出均勻白斑菌落，以M13a為引物(見表1)進行菌落PCR，鑒定后挑取陽性菌落置于5 mL含氨芐西林的LB中37℃，200 r/min培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶PstⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，陽性克隆質(zhì)粒送交上海生工生物工程股份有限公司測序后進行Blast序列比對[14-16].

表1 引物信息

1.3.2CoI基因cDNA 3′-RACE PCR

按照3′-RACE 試劑盒(SMARTer TM RACE cDNA Amplification Kit)的操作說明書先后進行兩輪巢式PCR.取3.75 μL總RNA為模板，1 μL 反轉錄接頭引物3′CDS primer A，72℃孵育4 min、42℃孵育2 min后離心，合成3′-RACE第一鏈[17].首輪PCR擴增產(chǎn)物稀釋100倍后取3 μL作為第二輪的模板.反應體系50 μL：3 μL 3′-RACE cDNA，1 μL上游引物CoI1F，4.5 μL下游引物UPM，1 μL dNTP Mix，1 μL Advantage 2 PCR Buffer (10×)，1 μL Advantage 2 Polymerase Mix (50×)，加滅菌ddH2O至50 μL.PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性50 s，58℃退火50 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸8 min.其他操作步驟同1.3.1.

1.3.3CoI基因cDNA 5′-RACE PCR

按照5′-RACE 試劑盒(SMARTer TM RACE cDNA Amplification Kit)的操作說明書先后進行兩輪巢式PCR，取3.75 μL總RNA為模板，1 μL接頭反轉錄引物5′CDS primer A，72℃孵育4 min、42℃孵育2 min后離心收集產(chǎn)物，取1 μL SMARTerⅡ Aoligo加入試管中，合成5′-RACE第一鏈.首輪PCR擴增產(chǎn)物稀釋100倍后取3 μL作為第二輪的模板.反應體系50 μL：3 μL 3′-RACE cDNA，5 μL上游引物UPM，1 μL下游引物CoI1R，1 μL dNTP Mix，1 μL Advantage 2 PCR Buffer (10×)，1 μL Advantage 2 Polymerase Mix (50×)，加滅菌ddH2O 至50 μL.PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性50 s，58℃退火50 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸8 min.其他操作步驟同1.3.1.

1.3.4CoI基因生物信息學分析

將克隆得到的紅光熊蜂CoI基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast序列比對驗證，采用DNAStar軟件中的SepMan對紅光熊蜂CoI全長cDNA序列進行拼接；采用在線軟件ORF Finder 查找紅光熊蜂CoI全長cDNA序列開放閱讀框(ORF)，利用DNAMAN軟件對紅光熊蜂CoI編碼蛋白進行生物信息學分析，并在NCBI中采用BlastP程序將其與11種昆蟲的CoI基因編碼的氨基酸序列進行多重比對分析；采用MEGA 7.0軟件鄰接法(neighbor-joining)基于氨基酸序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹.采用在線軟件ExPASy-ProtParam tool(http：∥www.expasy.org/tools/protparam.html)預測紅光熊蜂CoI基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；利用在線工具TMHMM Server v.1.0(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測紅光熊蜂CoI基因編碼蛋白跨膜區(qū)域.

2 結果與分析

2.1 紅光熊蜂CoI基因cDNA克隆與表達分析

通過RT-PCR技術克隆、拼接得到紅光熊蜂工蜂CoI基因全長cDNA序列，通過ORF Finder在線分析發(fā)現(xiàn)，CoI基因含有一個1 050 bp的開放閱讀框，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼349個氨基酸(見圖1).在NCBI數(shù)據(jù)庫進行的BlastP序列分析可見，CoI基因編碼氨基酸序列與熊蜂CoI基因序列的一致性最高可達98%，與其他昆蟲的同源一致性均在75%以上.

圖1 紅光熊蜂CoI基因ORF及其編碼氨基酸序列

2.2 紅光熊蜂CoI基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)預測

采用ExPASy-ProtParam tool(http：∥www.expasy.org/tools/protparam.html)軟件在線分析紅光熊蜂工蜂CoI基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)可知，CoI含1 050 bp，編碼349個氨基酸，預測蛋白質(zhì)分子式C1789H2724N422O463S25，相對分子質(zhì)量為38 350，理論等電點(pI)為5.79，偏酸性，半衰期為30 h；在CoI蛋白質(zhì)的氨基酸組成中亮氨酸(Leu)所占比例最高為12.9%，纈氨酸(Trp)比例最低為0.9%；氨基酸殘基帶正電荷的(Arg + Lys)為8個，帶負電荷的(Asp + Glu)為15個；CoI蛋白質(zhì)的平均親水系數(shù)為0.706，不穩(wěn)定性指數(shù)為39.98(一般不穩(wěn)定系數(shù)小于40的蛋白質(zhì)視為穩(wěn)定蛋白)，脂溶性指數(shù)110.92.上述結果表明CoI編碼的蛋白質(zhì)為帶負電的疏水性蛋白；采用在線軟件SignalIP(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP/)預測紅光熊蜂CoI基因編碼蛋白N端信號錨定序列，結果顯示，CoI蛋白具有信號肽，且信號肽的剪切位點位于第24和25號氨基酸之間(見圖2)，說明紅光熊蜂CoI蛋白可能為具信號肽的分泌蛋白.采用在線工具TMHMM Server v.1.0(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測紅光熊蜂CoI基因編碼蛋白具8個跨膜區(qū)域，蛋白質(zhì)的氨基端在膜外、羧基端在膜內(nèi)(見圖3)；采用3-D在線模型構建軟件Automatic Modeling Mode (http：∥swiss model.Eapasy.org/)構建三級結構，結果顯示，紅光熊蜂CoI蛋白質(zhì)具8個α-螺旋，與圖3中8個跨膜結構域相一致(見圖4).

C-score：剪切位點值；S-score：S值的變化趨勢；Y-score：S值和C值的綜合參數(shù)，每一個氨基酸分別對應一個S值和一個C值，當S值和C值均較高時即為信號肽的位置.

圖3 紅光熊蜂CoI基因預測的蛋白跨膜結構域

圖4 紅光熊蜂CoI蛋白的3-D結構預測模型

2.3 紅光熊蜂CoI編碼氨基酸聚類分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中將紅光熊蜂CoI編碼的氨基酸序列進行BlastP比對分析，采用軟件MEGA7.0的鄰接法對與紅光熊蜂CoI編碼的氨基酸同源性較高的昆蟲構建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖5).系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，中華蜜蜂(Apiscerana)、意大利蜜蜂(Apismellifera)和黑盾胡蜂(Vespabicolor)聚為一支；紅光熊蜂與地熊蜂(Bombusterrestris)聚為一支；紫棕象甲(Rhynchophorusphoenicis)、紅棕象甲(Rhynchophorusferrugineus)和棕櫚象甲(Rhynchophoruspalmarum)聚為一支；黃粉寄蠅(Tachinaflavosquama)、家蠅(Muscadomestica)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)聚為一支.由此可見，昆蟲的CoI編碼的氨基酸以目為單位各聚為支，膜翅目與鞘翅目進化關系較近，紅光熊蜂的CoI氨基酸序列與地熊蜂進化關系較近，相似性達95%，其中膜翅目中華蜜蜂與意大利蜜蜂進化關系較近(93%)，但雙翅目黃粉寄蠅與膜翅目紅光熊蜂的CoI氨基酸同源性不大，氨基酸序列同源性在35%～95%之間，這與昆蟲的進化關系一致.

注：意大利蜜蜂Apis mellifera，中華蜜蜂Apis cerana ，黑盾胡蜂Vespa bicolor，紅光熊蜂Bombus ignites，地熊蜂Bombus terrestri，紫棕象甲Rhynchophorus phoenicis，紅棕象甲Rhynchophorus ferrugineus，棕櫚象甲Rhynchophorus palmarum，黃粉寄蠅Tachina flavosquama，家蠅Musca domestica，黑腹果蠅Drosophila melanogaster.

3 討論

授粉是農(nóng)作物生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，而品質(zhì)和安全性已成為設施農(nóng)產(chǎn)品追求的目標，所以越來越多的人采用熊蜂授粉取代人工激素對溫室大棚果蔬進行授粉.但溫室果蔬為防治病蟲害而大量使用化學農(nóng)藥，嚴重影響熊蜂的健康與授粉，由NY/T2882.4—2016《農(nóng)藥登記環(huán)境風險評估指南第四部分：蜜蜂》的評估可見，大部分農(nóng)藥對熊蜂具經(jīng)口性毒性.

線粒體具雙層膜，電子傳遞鏈位于內(nèi)膜，細胞色素C氧化酶是內(nèi)膜的標志酶，而線粒體細胞色素C氧化酶被認為是化學農(nóng)藥主要作用的靶標，細胞色素C氧化酶是需氧菌和線粒體細胞內(nèi)膜電子傳遞鏈的終端氧化酶，也是各種農(nóng)藥的作用靶標[18].真核細胞細胞色素C氧化酶包含13個亞基，其中CoI，CoII和CoIII是3個最大的核心亞基，均由mtDNA編碼，且存在于絕大多數(shù)含血紅素/銅(heme/copper)的終端酶中，是分子生物學領域中研究物種遺傳多樣性、進化史、分類鑒定等方面應用較多的基因.目前對其他物種細胞色素C氧化酶的研究較為深入，而對紅光熊蜂細胞色素C氧化酶的研究尚未見報道.CoI基因是昆蟲分類特征的重要基因，穩(wěn)定且應用較廣，為分析紅光熊蜂CoI基因編碼的氨基酸特征和蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，以及紅光熊蜂的系統(tǒng)發(fā)育親緣關系提供了分子依據(jù)和基礎性資料[19-20].本實驗克隆了紅光熊蜂CoI基因，測序、預測了氨基酸序列及其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；采用RT-PCR和RACE技術得到細胞色素C氧化酶的開放閱讀框為1 050 bp，編碼349個氨基酸；利用Swiss Model在線分析軟件預測其含有8個跨膜結構，與其具有8個α-螺旋相一致，并且在第24和25號氨基酸之間存在信號肽的剪切位點，說明CoI有可能是分泌蛋白，且其5′端具有一段疏水性肽片段，其功能在于引導成熟的分泌蛋白跨膜進入目標位點.

線粒體mtDNA具有高拷貝數(shù)、母系遺傳且親緣進化率較恒定的特征，平均每百萬年提高約2%，使之成為流行的遺傳標記，評估分析系統(tǒng)發(fā)生率及進化關系[21].通過本實驗的系統(tǒng)進化樹分析可見，該序列與其他昆蟲CoI氨基酸具有較高的同源一致性，說明在長期的生物進化工程中，CoI亞基具有較高的保守性，可能與CoI是線粒體細胞色素C氧化酶的核心亞基有關；此外，昆蟲CoI編碼的氨基酸以目為單位各聚為支，膜翅目與鞘翅目進化關系較近，與雙翅目昆蟲相對較遠，這也符合昆蟲的進化關系.由此說明，雖然CoI亞基保守性較高，但在不同物種間仍具有一定程度的核苷酸差異性，進而可以解釋CoI亞基能在不同物種中行使其獨特的生物學功能，這為進一步明確CoI亞基在各物種間的功能、明確化學農(nóng)藥在熊蜂線粒體中的作用位點提供了依據(jù).