袁 楓 宋慧琦 侯 磊 韋 莉 朱珊珊 全 榮 王 菁 王 丹 姜海軍 劉 浩 劉 爵*

(1.天津科技大學 生物工程學院，天津 300222；2.北京市農(nóng)林科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097；3.揚州大學 獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009；4.揚州大學 江蘇省重大動物傳染病與人畜共患病防控合作創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009)

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的主要感染對象為3～5周齡的雛雞，感染后在一周內(nèi)會發(fā)病死亡。病死雞剖檢表現(xiàn)出心包積液-肝炎綜合征(Hydropericardium-hepatitis syndrome，HHS)的典型癥狀，心包內(nèi)積聚大量的液體，肝臟出現(xiàn)明顯的病毒包涵體，死亡率達到30%～80%[1-2]。2013 HHS傳入我國后只見散發(fā)性流行[3-4]，直到2015后，超強毒力的禽腺病毒血清4型(hvFAdV-4)已成為國內(nèi)HHS的主要的病原體，導(dǎo)致雞群的死亡率節(jié)節(jié)攀升，給國內(nèi)外的養(yǎng)禽業(yè)帶來極大威脅[5]。

自2010年以來，研究者們采用細胞培養(yǎng)系統(tǒng)相繼地研發(fā)出禽腺病毒血清4型的滅活疫苗和弱毒疫苗[6-10]，其中部分疫苗保護率可高達100%[8]。但是這類疫苗產(chǎn)量有限、成本較高，而且容易出現(xiàn)病毒滅活不完全或毒力返強的現(xiàn)象，存在著很大的生物安全隱患。近年來，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，亞單位疫苗作為新一代疫苗憑借著成本低、產(chǎn)量高、安全可靠和保護效果好等優(yōu)點，在傳染性疾病預(yù)防方面已廣泛應(yīng)用。

在FAdV-4的亞單位疫苗研究中，主要應(yīng)用的表達系統(tǒng)有大腸桿菌[11-13]、昆蟲細胞[14-15]和哺乳動物細胞[16]等。研究人員利用不同的表達系統(tǒng)進行了病毒結(jié)構(gòu)蛋白(Fiber-1、Fiber-2[17]、Hexon和Penton)和非結(jié)構(gòu)蛋白(100 K)的外源表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的蛋白保護效率差異性較大，這些系統(tǒng)表達的結(jié)構(gòu)蛋白Fiber-1、Penton和Hexon雖然都能提供一定程度的保護，但是無法完全抵御FAdV-4的感染，而非結(jié)構(gòu)蛋白(100 K)幾乎不能刺激機體產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)[18]。Fiber-2是FAdV-4特有的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒感染過程中的吸附和進入中發(fā)揮重要作用[19]。研究表明，不同系統(tǒng)表達的Fiber-2蛋白均可激發(fā)機體產(chǎn)生高效的免疫保護力[20-21]。

目前，為制備FAdV-4 Fiber-2蛋白的亞單位疫苗，很多研究采用了原核表達系統(tǒng)(大腸桿菌)和真核表達系統(tǒng)(昆蟲細胞和畢赤酵母)對Fiber-2蛋白進行了表達[11-13,15,22]。雖然，大腸桿菌生長繁殖快、培養(yǎng)簡單，但是表達的蛋白無法進行有效折疊和修飾，導(dǎo)致不能激發(fā)機體產(chǎn)生高效免疫應(yīng)答。真核表達系統(tǒng)表達的病毒蛋白與活病毒更為接近，更有利于刺激機體產(chǎn)生高效的免疫應(yīng)答。在所有的真核表達系統(tǒng)中，畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統(tǒng)由于其具有菌體繁殖快、培養(yǎng)基廉價，而且還能對目的蛋白進行折疊和修飾并以外分泌的形式表達的優(yōu)勢。同時，經(jīng)過優(yōu)化后的畢赤酵母表達系統(tǒng)有著很高的產(chǎn)量，外分泌的目的蛋白可以達到g/L。如此高的產(chǎn)量是其他原核和真核表達系統(tǒng)都無法做到的，因此，近年來畢赤酵母表達系統(tǒng)被研究者廣泛用于亞單位疫苗的制備。

雖然先前有關(guān)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FAdV-4 Fiber-2蛋白可在畢赤酵母表達系統(tǒng)進行表達[22]，然而其表達量及蛋白純度較低，無法滿足批量化生產(chǎn)的需求。在實際生產(chǎn)實踐中，通常未經(jīng)優(yōu)化的畢赤酵母表達系統(tǒng)表達的蛋白量較低，并達不到應(yīng)用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的需求。因此，通過酵母發(fā)酵工藝的優(yōu)化來提高外源蛋白的表達，對亞單位疫苗的制備至關(guān)重要[23-25]。本研究旨為提高Fiber-2蛋白在畢赤酵母(P.pastoris)表達系統(tǒng)中的外分泌表達，將病毒的Fiber-2基因按照酵母密碼子偏好進行了優(yōu)化，然后通過不同濃度的G418選取高拷貝的重組菌株后，采用搖瓶優(yōu)化誘導(dǎo)溫度、時間和甲醇濃度。并采用動物試驗評估了優(yōu)化后的畢赤酵母表達Fiber-2蛋白制備的亞單位疫苗對高致病性FAdV-4毒株(GD616)的免疫保護作用。該研究成果為FAdV-4亞單位疫苗進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)GD616毒株和Fiber-2豚鼠多克隆抗體由研究室保存；酵母真核載體pPIC9K和畢赤酵母菌(P.pastoris)GS115株由蘇州泓迅生物公司提供；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ和SacⅠ購自NEB公司；HRP標記的羊抗豚鼠IgG和羊抗雞IgG購自Sigma公司；氨芐霉素(Amp+)購自Invitrogen公司；增強型HRP底物顯色試劑盒購自Thermo公司；ISA-201-VG免疫油佐劑購自SEPPIC公司;純化所用的鎳柱(HisTrapTM FF，5 mL)購買于GE公司；PierceTMBCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Scientific；SPF雞購自購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。BMGY培養(yǎng)基和BMMY培養(yǎng)基自配。

1.2 Fiber-2基因序列的密碼子優(yōu)化和pPIC9K-Fiber-2載體構(gòu)建

根據(jù)研究室測得FAdV-4-GD616毒株的Fiber-2基因序列，對該基因序列進行酵母密碼子偏好性優(yōu)化，全序列由蘇州泓迅生物合成。優(yōu)化后序列連接至酵母真核載體pPIC9K載體上，命名為pPIC9K-Fiber-2。優(yōu)化過的全序列編碼485個氨基酸，包括Fiber-2蛋白以及His標簽(6-His)。

利用網(wǎng)絡(luò)公共平臺提供(http:∥www.cbs.dtu.dk/)的軟件TMHMM和SignalP 3.0 Server，預(yù)測Fiber-2蛋白質(zhì)的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。

根據(jù)對優(yōu)化后的Fiber-2基因全序列設(shè)計檢測引物，F(xiàn)1：5’-ATGTTGAGAGCCCCAAAGAGAAGAC-3’；R1：5’-GTGATGGTGGTGATGATGTGGAAC T-3’，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化

將重組質(zhì)粒pPIC9K-Fiber-2導(dǎo)入大腸埃希菌TOP10進行大量擴增后提取質(zhì)粒。取部分質(zhì)粒進行EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切分析。隨后取5 μg重組質(zhì)粒pPIC9K-Fiber-2用SacⅠ酶對其進行線性化單酶切，并用2倍體積無水乙醇沉淀回收，30 μL ddH2O溶解。取100 μL酵母感受態(tài)細胞加入30 μL 線性化的質(zhì)粒，混合后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯(d=0.2 cm)中，冰上放置數(shù)分鐘后，放入電轉(zhuǎn)儀中電擊(電壓：1680 V，電擊時間：5 ms)，電擊后，立刻加入1 mL 1 mol/L的D-山梨醇，冰上放置數(shù)分鐘。隨后放置28 ℃培溫搖床內(nèi)培養(yǎng)1 h。分別取pPIC9K-Fiber-2和pPIC9K(對照)轉(zhuǎn)化菌液100～200 μL涂布于MD平板。48 h后觀察平板菌落長勢。

1.4 高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及PCR鑒定

用無菌ddH2O將MD平板上的酵母菌落洗脫至無菌的離心管中，按每平皿1×105個細胞涂于含G418不同質(zhì)量濃度的YPD平皿，其中G418質(zhì)量濃度分別為1、3和5 mg/mL。經(jīng)3～5 d培養(yǎng)后，G418抗性克隆長出。從3 mg/mL的YPD-G418平板上挑取8個單克隆至4 mL YPD液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)36 h。取500 μL菌液至1.5 mL EP管中，離心收集菌體，使用酵母基因組DNA提取試劑盒提取酵母菌的基因組。用引物F1和R1進行PCR擴增驗證。

1.5 畢赤酵母誘導(dǎo)表達及其優(yōu)化

1.5.1搖瓶接種菌的制備

取出-80 ℃保存的酵母菌種，接種2 mL發(fā)酵種于100 mL的BMGY培養(yǎng)基中，放置搖床并將參數(shù)設(shè)置為300 r/min和28 ℃進行培養(yǎng)，最終OD600至3～6(約16～24 h)。離心收集菌體。

1.5.2誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

將準備好的重組菌放在BMMY培養(yǎng)基中分別以不同溫度(24、26、28和30 ℃)進行誘導(dǎo)表達，接下來每24 h向培養(yǎng)基中添加總體積的1.0%甲醇，在96 h后將菌液離心取上清放在-80 ℃ 保存。先用BCA檢測上清中蛋白含量，再將剩余的上清液進行三氯乙酸蛋白沉淀，采用SDS-PAGE和Western Blot檢測，以確定最適的誘導(dǎo)溫度。

1.5.3誘導(dǎo)時間的優(yōu)化

將準備好的菌體用100 mL的BMMY培養(yǎng)基重懸。放在搖床上并將參數(shù)設(shè)置為30 ℃ 250 r/min繼續(xù)生長。每24 h加入培養(yǎng)液總體積1.0%的甲醇并培養(yǎng)120 h。開始誘導(dǎo)后每天將部分菌液離心取上清用BCA檢測上清中蛋白含量，并將上清濃縮后進行SDS-PAGE和Western Blot檢測，以確定最適的誘導(dǎo)時間。

1.5.4甲醇誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化

根據(jù)確定好的最佳誘導(dǎo)時間和溫度，每24 h添加的甲醇分別為(0.5%、1.0%、2.0%和3.0%)。在30 ℃誘導(dǎo)72 h后取上清檢測蛋白表達及含量，以確定最適的甲醇誘導(dǎo)濃度。

1.5.5發(fā)酵液蛋白濃縮及檢測

取出900 μL上清加入三氯乙酸置于冰上10 min。離心后棄上清液加入1 mL丙酮震蕩渦旋在-20 ℃冰柜中過夜進行沉淀。12 000 r/min離心10 min，收取沉淀并加入20 μL ddH2O和4 μL上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，進行SDS-PAGE和Western Blot檢測。

Western Blot檢測，在進行SDS-PAGE后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，5%脫脂奶封閉NC膜過夜。TBST洗膜1次，加Fiber-2蛋白豚鼠多克隆抗體孵育2 h；PBST洗膜4次(10 min/次)，加HRP標記的羊抗豚鼠IgG二抗孵育1 h。TBST洗膜3次(10 min/次)，加增強型HRP底物顯色液避光反應(yīng)5 min后成像檢測。

1.6 Fiber-2重組蛋白的純化和檢測

在搖瓶中誘導(dǎo)表達72 h后，收取菌液12 000 rmp/min 離心10 min，收取發(fā)酵上清液用0.22 μm水系濾膜過濾，利用BCA試劑盒檢測上清液中的總蛋白含量。隨后將過濾后的上清液過鎳柱純化，按照HisTrapTMHP的使用說明書進行，最終用500 mmol/L濃度的咪唑洗脫緩沖液洗脫目標蛋白，并用透析進行脫鹽處理，再用BCA試劑盒檢測Fiber-2蛋白含量。

1.7 畢赤酵母表達的重組 Fiber-2蛋白的免疫保護效力評估

1.7.1動物試驗設(shè)計

先將純化后的Fiber-2蛋白分為0、20和 50 μg，然后與ISA-201-VG免疫油佐劑等體積混合(1∶1)。將35只21日齡SPF雞分成4組(PBS對照組、Fiber2-20 μg組和Fiber2-50 μg組(每組10只)，空白組(Sham)5只)，分別胸肌多點注射重組Fiber-2蛋白，對照組注射PBS，空白組不做處理。共免疫2次，免疫間隔時間為一周，二免后7天將FAdV-4-GD616病毒液稀釋至103.5TCID50/0.1 mL，肌肉接種感染3組雞(0 μg、20 μg和50 μg/只/組)，每只0.2 mL。

1.7.2免疫后的血清ELISA抗體檢測

分別于免疫后7 d和二免后7 d后翅靜脈采血，收集血清。用ELISA進行抗體檢測，采用濃度為5 μg/mL 的Fiber-2蛋白包被過夜，用 5%的脫脂奶粉在37 ℃封閉2 h，漂洗后將稀釋200倍后的血清加入，孵育2 h；漂洗后加入5 000倍稀釋的羊抗雞IgG-HRP酶標抗體，37 ℃反應(yīng)50 min；漂洗后加TMB避光反應(yīng)15 min，在終止后讀取OD450吸光度值。

1.7.3攻毒后雞群保護率

攻毒后每天觀察雞的健康狀況，記錄死亡和存活的數(shù)量，并進行保護率的計算。

1.7.4攻毒后雞群病理組織觀察

PBS組隨機選取病死雞進行剖檢并收集肝臟；空白組(Sham)和50 μg組在攻毒后第7天隨機選取雞進行剖檢并收集肝臟；將收集的肝臟用4%的多聚甲醛固定，在石蠟包埋后切片，并對切片進行HE和免疫組化染色(HIC)。HIC選取課題組制備的Fiber-2豚鼠多克隆抗體。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fiber-2基因密碼子優(yōu)化

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的Fiber-2基因長為1 440 bp，按照酵母密碼子的偏好，將Fiber-2基因序列按進行了優(yōu)化(圖1)。優(yōu)化的過程中選擇性避開EcoRⅠ、NotⅠ和SacⅠ酶切序列的出現(xiàn)。將EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點在優(yōu)化時加在CDS序列兩端，以便插入載體的多克隆位點。在Fiber-2蛋白的N端添加了6×His標簽和2個終止密碼子(TGA)，序列最終長度為1 475 bp。最后對Fiber-2氨基酸序列分析顯示蛋白不存在跨膜區(qū)和信號肽。

*為終止密碼子序列。* represent the termination codon sequence.圖1 根據(jù)酵母密碼子偏好優(yōu)化后的Fiber-2基因和氨基酸序列Fig.1 Fiber-2 gene and amino acid sequence optimized according to yeast codon preference

2.2 高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子篩選及PCR鑒定

高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子篩選結(jié)果顯示，含有5 mg/mL G418的YPD平板上并未發(fā)現(xiàn)菌落生長，含3 mg/mL G418的YPD平板上有8個高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子(圖2(a))。挑取上述陽性轉(zhuǎn)化子，用優(yōu)化序列的Fiber-2引物F1和R1進行PCR擴增。結(jié)果顯示所有轉(zhuǎn)化子均出現(xiàn)了約為1 500 bp的目的條帶(圖2(b))。

(a)Ⅰ是G418濃度為1 mg/mL的MD培養(yǎng)基；Ⅱ是G418濃度為3 mg/mL的MD培養(yǎng)基；Ⅲ是G418濃度為3 mg/mL的MD培養(yǎng)基；(b)1～8為G418濃度為3 mg/mL的MD培養(yǎng)基中的8個高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子。(a)Ⅰ indicates MD medium with 1 mg/mL of G418,Ⅱ indicates MD medium with 3 mg/mL of G418,and Ⅲ was MD medium with 3 mg/mL of G418.(b)1-8 indicate 8 high copy positive transformants in MD medium with 3 mg/mL of G418.圖2 高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子的篩選(a)及PCR鑒定(b)Fig.2 Screening (a)and PCR identification (b)of high copy positive transformants

2.3 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

誘導(dǎo)溫度在28 ℃以上時重組蛋白表達顯著增加，在30 ℃時到達峰值。因此最佳溫度為30 ℃。根據(jù)圖3(a)和(b)結(jié)果顯示，培養(yǎng)液中的雜蛋白雖然會隨溫度增加而變多，但是并沒有影響Fiber-2蛋白的表達。

1～4：分別為誘導(dǎo)溫度為24、26、28和30 ℃時蛋白的濃縮液。M：蛋白分子量標準。1-4:the protein concentrate was induced at 24,26,28,and 30 ℃,respectively.M:Protein molecular weight standard.圖3 不同誘導(dǎo)溫度表達產(chǎn)物的SDS-PAGE (a)和Western blot (b)鑒定Fig.3 SDS-PAGE (a)and Western blot (b)identification of products expressed at different induction temperatures

2.4 誘導(dǎo)時間的優(yōu)化

分別收取誘導(dǎo)后24、48、72、96和120 h的發(fā)酵上清液進行濃縮，檢測發(fā)現(xiàn)上清液中雜質(zhì)蛋白會隨著誘導(dǎo)時間逐漸的增多(圖4(a))。根據(jù)Western結(jié)果顯示，這些增多的雜質(zhì)蛋白并不是重組Fiber-2蛋白的片段(圖4(b))。上清液的總蛋白含量在72 h 達到表達峰值，此后的時間點沒顯著增加。PAGE和Western結(jié)果顯示誘導(dǎo)72 h的Fiber-2蛋白表達最高，即使延長發(fā)酵也無法提高表達量。綜上，在72 h停止發(fā)酵并回收目的蛋白最為適宜。

1～5：分別為誘導(dǎo)24、48、72、96和120 h培養(yǎng)基的蛋白濃縮液。6：空白酵母誘導(dǎo)96 h后培養(yǎng)基的蛋白濃縮液。M：蛋白分子量標準。1-5:the protein concentrate of induction medium for 24,48,72,96,and 120 h,respectively.6:the protein concentration of the culture medium was induced by blank yeast for 96 hours.M:Protein molecular weight standard.圖4 不同誘導(dǎo)時間表達產(chǎn)物的SDS-PAGE(a)和Western blot鑒定Fig.4 SDS-PAGE (a)and Western blot (b)identification of expression products with different induction time

1～4：甲醇誘導(dǎo)濃度分別為0.5%、1.0%、2.0% 和3%時的蛋白濃縮液。M：蛋白分子量標準。1-4:the protein concentrate was induced by methanol at concentrations of 0.5%,1.0%,2.0% and 3.0%,respectively.M:Protein molecular weight standard.圖5 不同甲醇誘導(dǎo)濃度表達產(chǎn)物的SDS-PAGE(a)和Western blot(b)鑒定Fig.5 SDS-PAGE (a)and Western blot (b)detection of expressed products at different methanol induced concentrations

2.5 甲醇誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化

誘導(dǎo)表達開始后，每隔24 h分別添加不同體積分數(shù)的甲醇，體積為發(fā)酵液總量的0.5%、1.0%、2.0%和3.0%，72 h后收取各組上清液進行檢測。結(jié)果顯示Fiber-2蛋白的表達量在甲醇濃度為1.0%時最高，添加量過大反而抑制了Fiber-2蛋白的表達。所以將最佳的甲醇誘導(dǎo)濃度確定為1.0%。

2.6 Fiber-2蛋白純化及檢測

優(yōu)化后發(fā)酵上清中總蛋白含量達到約50 mg/L，同時重組蛋白Fiber-2的產(chǎn)量為8.7 mg/L。上清液經(jīng)過鎳柱親和層析純化后的蛋白條帶單一，說明重組蛋白Fiber-2可以通過鎳柱親和層析的方法純化(圖6(a))。Western blot檢測結(jié)果顯示的蛋白在60 ku左右，與預(yù)期結(jié)果相符(圖6(b))。

純化后的Fiber-2蛋白進行PAGE (a)和Western (b)檢測。M：蛋白分子量標準；1：純化后的Fiber-2蛋白。The purified Fiber-2 protein was detected by PAGE (a)and Western blot (b)M:Protein molecular weight standard;1:Purified Fiber-2 protein.圖6 Fiber-2蛋白純化后的檢測Fig.6 Detection of purified Fiber-2 protein

2.7 免疫攻毒保護試驗

ELISA抗體檢測結(jié)果顯示，20和50 μg免疫組在首免后1周出現(xiàn)特異性抗體，之后抗體水平持續(xù)上升，二免疫后1周達到高峰期。同時發(fā)現(xiàn)疫苗免疫劑量越大，特異性抗體水平也越高，PBS對照組在動物試驗期間未產(chǎn)生Fiber-2的特異性抗體(圖7(a))。超強致病性FAdV-4毒株GD616感染后，PBS免疫組的死亡率為100%(10/10)，20 μg重組Fiber-2蛋白組為10%(1/10)，50 μg重組Fiber-2蛋白組并沒有雞出現(xiàn)死亡(圖7(b))。結(jié)果說明重組Fiber-2蛋白免疫組較PBS對照組有明顯的保護作用，并且50 μg的免疫對超強毒株的感染可起到100%的保護。

圖7 免疫后的抗體水平(a)和攻毒后的生存曲線(b)Fig.7 Antibody level (a)after immunization and survival curve (b)after challenge

2.8 動物試驗病理學分析

對空白組、PBS組和50 μg組中的雞進行剖檢，隨后取肝臟切片并進行HE和病毒Fiber-2蛋白的免疫組化檢測(圖8)。結(jié)果顯示，PBS免疫組在GD616后出現(xiàn)典型的HHS的病變，而50 μg免疫組中并沒發(fā)現(xiàn)病變。隨后切片的HE和免疫組化(HIC)染色結(jié)果顯示，PBS組的肝臟出現(xiàn)了典型的病毒包涵體，脂肪變性和炎性細胞沁潤的病理學變化。而在空白組和50 μg組中并沒有發(fā)現(xiàn)病理變化和病毒的Fiber-2蛋白陽性著色。表明50 μg重組蛋白免疫對肝臟有很好的免疫保護效果。

箭頭a：FAdV-4病毒包涵體；箭頭b：脂肪空泡；c：炎性細胞浸潤。Arrow a:FAdV-4 virus inclusion body;Arrow b:Fat vacuoles;c:Inflammatory cell infiltration.圖8 肝臟病理組織切片觀察(HE和HIC(Fiber-2)，20×)Fig.8 Observation of pathological sections of liver (HE and HIC (Fiber-2),20×)

3 討 論

3.1 Fiber-2蛋白在畢赤酵母中的優(yōu)化表達

畢赤酵母(P.pastoris)表達系統(tǒng)生長迅速，產(chǎn)量高，價格便宜易，可以進行高密度發(fā)酵，且不具有原核表達的內(nèi)毒素污染問題。同時該系統(tǒng)已經(jīng)有現(xiàn)成的工業(yè)化發(fā)酵平臺，技術(shù)成熟。因此綜合“量”與“質(zhì)”兩方面的考慮，選取畢赤酵母表達系統(tǒng)開發(fā)FAdV-4的亞單位疫苗具有廣闊的應(yīng)用前景。盡管畢赤酵母表達系統(tǒng)具有完善的表達調(diào)控機制和對表達產(chǎn)物的加工修飾能力，但由于外源基因及表達條件等諸多的因素影響，仍然會有外源蛋白表達量很低，甚至無法表達的問題存在。因此，外源基因的優(yōu)化、畢赤酵母菌種篩選和誘導(dǎo)條件的改進已成為推進畢赤酵母表達系統(tǒng)成為強有力的外源蛋白表達工具的重要環(huán)節(jié)[26]。李思齊[22]研究雖然在畢赤酵母中對Fiber-2蛋白進行了外分泌表達，但側(cè)重點在于Fiber-2蛋白的成功表達和保護效果的評價。其研究并未對發(fā)酵的工藝進行優(yōu)化，同時也未能對Fiber-2蛋白的表達量進行準確定量，這限制了畢赤酵母表達的Fiber-2蛋白作為FAdV-4亞單位疫苗的發(fā)展。

本研究首先對Fiber-2基因按照酵母密碼子進行優(yōu)化，因為在采用畢赤酵母進行的羥腈裂解酶表達研究中發(fā)現(xiàn)，羥腈裂解酶基因在按照酵母密碼子進行優(yōu)化后，可以使表達量提高約140倍[27]。血纖維蛋白溶解酶、乙肝表面抗原(HBsAg)和堿性果膠酸裂合酶的研究結(jié)果表明，提高外源基因在酵母基因組中的拷貝數(shù)有很的大概率增加外源蛋白的表達水平[28-30]。所以本研究通過不同質(zhì)量濃度的G418(1、3和5 mg/mL)篩選了高拷貝菌株。接下來本研究通過誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，將培養(yǎng)基上清液中的總蛋白含量從最初的30 mg/L提升到了50 mg/L，最終上清中的重組Fiber-2蛋白含量達到了8.7 mg/L。本文旨在通過發(fā)酵工藝的初步優(yōu)化來提高重組Fiber-2蛋白的產(chǎn)量，以推動畢赤酵母表達系統(tǒng)在FAdV-4亞單位疫苗中的工業(yè)化發(fā)展進程。

3.2 畢赤酵母優(yōu)化表達的重組Fiber-2蛋白對國內(nèi)超強毒力毒株(GD616)的攻擊保護效果

本研究中采用的超強毒力的FAdV-4毒株(GD616)是由本研究室分離鑒定的。根據(jù)先前的研究結(jié)果，該毒株以101.5TCID50接種21日齡的SPF雞群的死亡率可達90%，并且可以造成肝臟明顯的脂肪變性[31]。感染180日齡的SPF雞可造成60%的發(fā)病率和20%的死亡率。本研究采用酵母表達的Fiber-2蛋白亞單位疫苗50 μg免疫的保護率為100%，為進一步驗證保護效果，本研究對免疫攻毒后雛雞進行病理學檢測，發(fā)現(xiàn)50 μg免疫雞群可以完全預(yù)防心包積液-肝炎綜合征(HHS)的發(fā)生，同時可以有效阻止超強毒株對于雞群肝臟的感染和損傷。

大量的研究表明，成功表達Fiber-2蛋白的系統(tǒng)還有很多，如大腸桿菌[11-13]、桿狀病毒[14]和293T[16]等，這些表達系統(tǒng)制備的亞單位疫苗免疫雞群后均可以抵抗2015年國內(nèi)不同地區(qū)的FAdV-4流行毒株，保護率均可達100%，但是對攻毒毒株的強弱程度沒有進一步說明。在本研究中，畢赤酵母優(yōu)化表達的重組Fiber-2蛋白免疫雞群后使用的是2015年后中國的流行毒株—超強毒力毒株GD616，保護率也可達到100%，充分表明畢赤酵母優(yōu)化表達的重組Fiber-2蛋白對超強毒株也具有很強的攻擊保護力。本研究確定了Fiber-2蛋白對超強FAdV-4毒株攻擊保護的高效性，為采用Fiber-2亞單位疫苗對國內(nèi)流行超強FAdV-4毒株進行有效的防控奠定了基礎(chǔ)。