湯守元 蘭國(guó)玉 黃耿 朱鐘鐘 羅海平 姜進(jìn)平

1鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）胃腸肛腸外科 435000；2鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）泌尿外科 435000

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，也是腫瘤相關(guān)死亡的主要原因，結(jié)直腸癌發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，且其發(fā)病率在不斷上升［1］。惡性增殖和凋亡減少是結(jié)直腸癌細(xì)胞的重要生物學(xué)特征，結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡水平的改變與眾多分子信號(hào)通路的激活或失活有關(guān)［2］。因此，結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的研究有助于結(jié)直腸癌新型治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。微小RNA（miRNA，miR）的表達(dá)與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖活力和凋亡水平有關(guān)，體外研究和體內(nèi)研究均表明miRNA 參與調(diào)控結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，與結(jié)直腸癌的臨床分期、惡性程度、化療耐藥等相關(guān)［3-4］。研究顯示，黑色素瘤患者血清中存在miR-4731，相對(duì)于Ⅲ期黑色素瘤患者，miR-4731 在Ⅳ期患者的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤組織中表達(dá)較少，miR-4731 過(guò)表達(dá)能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞的集落形成，miR-4731 表現(xiàn)為抑癌基因作用［5］。miR-4731-5p 對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響及其作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在觀察miR-4731-5p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖活力和凋亡水平的作用，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑 結(jié)直腸癌HT-29 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；陰性序列miR-NC、miR-4731-5p 類(lèi)似物購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒購(gòu)于購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；超敏ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司；蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司；一抗CDK3、GAPDH、c-IAP1、富含脯氨酸蛋白11（proline-rich protein 11，PRR11）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 取出液氮罐凍存的結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞，快速?gòu)?fù)蘇后接種于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29 細(xì)胞接種于24 孔板，按照Lipofectamine 3000 試劑說(shuō)明書(shū)，分別轉(zhuǎn)染miR-4731-5p 類(lèi)似物（miR-4731-5p組）和陰性對(duì)照miR-NC（miR-NC 組）。轉(zhuǎn)染8 h 后更換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h分析轉(zhuǎn)染效率。

1.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-4731-5p 的靶基因 采用生物信息學(xué)軟件miRTarBase 分析miR-4731-5p 的靶基因，PRR11 基因信使RNA（mRNA）存在miR-4731-5p 的結(jié)合位點(diǎn)，提示PRR11可能是miR-4731-5p的靶基因。

1.4 qRT-PCR 檢 測(cè)miR-4731-5p 和PRR11 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 提取轉(zhuǎn)染24 h 的HT-29 細(xì)胞總RNA，分別檢測(cè)RNA 純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。配制qRT-PCR 反應(yīng)液，miR-4731-5p 的相對(duì)表達(dá)量以U6 為內(nèi)參，PRR11 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量以GAPDH 為內(nèi)參。引物序列如下：miR-4731-5p正向引物5’-CACACTCATGTGGCCCCCAGC-3’，反向引物5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ；U6 正向引物5’-TGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTC-3’，反向引物5’-CCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；GAPDH 正向引物 5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反向引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；PRR11 正向引物5’-GAAGCTGGCTAACATCATCCTG-3’，反向引物5’-CTCTGGGTTATGCAGTTCTGG-3’。根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-4731-5p和PRR11 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western blot 檢測(cè)HT-29 細(xì)胞中PRR11 蛋白表達(dá)量 收集轉(zhuǎn)染48 h 的HT-29 細(xì)胞，配制蛋白裂解液并提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，每組取20 μg 蛋白樣品電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，7%脫脂牛奶在搖床上封閉4 h。依照稀釋比為1∶1 000配制一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。依照稀釋比為1∶5 000配制二抗，室溫?fù)u床孵育4 h。配制發(fā)光液，在每條條帶上滴加發(fā)光液，在熒光成像儀中曝光和拍照。

1.6 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-4731-5p 對(duì)HT-29 細(xì)胞增殖的影響 收集轉(zhuǎn)染48 h 的HT-29 細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔接種于6 孔板，每組3 個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)14 d。將集落與3%的多聚甲醛進(jìn)行混合，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的結(jié)晶紫溶液染色40 min。流水清洗，在室溫下晾干，計(jì)數(shù)集落形成數(shù)，計(jì)算平均值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-4731-5p對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響 收集轉(zhuǎn)染48 h 的HT-29 細(xì)胞，采用PBS 溶液洗滌4 次，離心棄上清，采用600 μl 結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC 溶液充分混勻，加入5 μl 碘化丙啶溶液充分混勻。避光孵育20 min 后，采用流式細(xì)胞儀分析每組HT-29細(xì)胞的凋亡率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組HT-29 細(xì)胞中miR-4731-5p 的相對(duì)表達(dá)量miR-NC 組和miR-4731-5p 組HT-29 細(xì)胞中miR-4731-5p的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.05±0.16）和（7.91±1.26），miR-4731-5p 組miR-4731-5p 的表達(dá)是miR-NC 組的7.53倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-4731-5p 的靶基因 采用生物信息學(xué)軟件miRTarBase 對(duì)miR-4731-5p 的靶基因預(yù)測(cè)，miR-4731-5p 的靶基因可能是PRR11，miR-4731-5p 可能與PRR11基因mRNA的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖1。

圖1 miR-4731-5p與PRR11基因mRNA互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)

2.3 過(guò)表達(dá)miR-4731-5p對(duì)PRR11 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 miR-NC 組和miR-4731-5p 組HT-29 細(xì)胞中PRR11 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.02±0.12）和（0.28±0.11），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示miR-4731-5p 可有效抑制PRR11 mRNA的表達(dá)。

2.4 過(guò)表達(dá)miR-4731-5p 對(duì)PRR11 蛋白表達(dá)量的影響 Western blot 結(jié)果（圖2）表明，miR-4731-5p 組HT-29 細(xì)胞中PRR11 蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞增殖蛋白CDK3表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡抑制蛋白c-IAP1表達(dá)降低。

圖2 miR-4731-5p對(duì)HT-29細(xì)胞PRR11蛋白表達(dá)的影響

2.5 過(guò)表達(dá)miR-4731-5p 對(duì)HT-29 細(xì)胞增殖水平的影響 如圖3，miR-NC 組和miR-4731-5p 組HT-29 細(xì)胞的集落形成數(shù)分別為（148.90±20.55）個(gè)和（51.25±12.81）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示miR-4731-5p 可抑制結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞的增殖。

圖3 miR-4731-5p對(duì)HT-29細(xì)胞增殖能力的影響

2.6 過(guò)表達(dá)miR-4731-5p 對(duì)HT-29 細(xì)胞凋亡能力的影響 如圖4，miR-NC 組和miR-4731-5p 組HT-29 細(xì)胞凋亡率分別為（5.79±0.72）%和（22.19±2.62）%。與miR-NC 組相比，miR-4731-5p 組HT-29 細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示miR-4731-5p 可促進(jìn)結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞凋亡。

圖4 miR-4731-5p對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡水平的影響

3 討 論

最近的系列研究表明，miRNA 在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，顯著影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的代謝、分化、生長(zhǎng)及凋亡等過(guò)程，表現(xiàn)為明顯的抑癌基因或致癌基因作用［6-7］。Zhang等［8］研究發(fā)現(xiàn)，miR-802在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)，miR-802表達(dá)水平低的結(jié)直腸癌患者淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率顯著升高，且總生存率更差，轉(zhuǎn)染miR-802模擬物顯著減弱結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Liu 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，有轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者血清外泌體miR-106b-3p的表達(dá)水平顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移患者，血清外泌體miR-106b-3p 高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，外泌體miR-106b-3p 在體內(nèi)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。其中，miR-4731-5p 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等腫瘤組織中低表達(dá)，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［5，10］。miR-4731-5p 對(duì)結(jié)直腸癌增殖和凋亡水平的調(diào)控尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-4731-5p 后，HT-29 細(xì)胞增殖活力降低，細(xì)胞凋亡率增加，表明miR-4731-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表現(xiàn)為抑癌基因作用。已有研究證實(shí)，miRNA以不完全互補(bǔ)的方式配對(duì)結(jié)合靶基因mRNA，誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的形成，降低靶基因的表達(dá)［11］。本研究采用生物信息學(xué)軟件miRTarBase 預(yù)測(cè)顯示，miR-4731-5p 可能與PRR11基因mRNA 配對(duì)結(jié)合。PRR11基因定位于人類(lèi)染色體17q22，由360 個(gè)氨基酸組成［12］。PRR11 蛋白在胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，與組織分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小相關(guān)，沉默PRR11 可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［13-15］。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-4731-5p 后，HT-29 細(xì)胞中PRR11 基因的相對(duì)表達(dá)量較miR-NC 組降低，表明miR-4731-5p 參與結(jié)直腸癌的機(jī)制可能是通過(guò)抑制PRR11 基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。本研究Western blot 結(jié)果顯示，miR-4731-5p 抑制PRR11 基因表達(dá)后，HT-29 細(xì)胞中增殖蛋白CDK3表達(dá)降低，凋亡抑制蛋白c-IAP1表達(dá)降低，提示HT-29細(xì)胞的增殖水平降低，細(xì)胞凋亡增加。

總之，過(guò)表達(dá)miR-4731-5p 可抑制結(jié)直腸癌HT-29 細(xì)胞的增殖活力，誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡增加，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制PRR11基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突。