黃芳 畢瑋 孫楊 劉玉普 李偉

1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院口腔科，福建 361015；2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院口腔科，上海 200032；3復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系，上海 200438

目前臨床上廣泛使用的口腔種植體基底材料多數(shù)為鈦及其合金材料［1］，然而，由于鈦基金屬表面易形成致密氧化薄膜［2-3］，導(dǎo)致植體的骨結(jié)合能力大大降低［4-5］，因此對植體表面進(jìn)行改性和修飾，以提高植體早期骨結(jié)合能力成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)［6-8］。其中，將具有較強(qiáng)誘導(dǎo)成骨能力的生長因子負(fù)載于植體表面，以提高鈦表面的骨結(jié)合能力，是對鈦基種植體進(jìn)行表面改性的一個重要途徑［9］。

在骨生長因子方面，目前已有研究證明骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）是BMPs 中具有最強(qiáng)成骨誘導(dǎo)能力的生長因子［10-14］。其在機(jī)體內(nèi)可誘導(dǎo)大量未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成成骨細(xì)胞，促進(jìn)早期成骨［15］；同時又能刺激成骨細(xì)胞的增殖、分化，提高堿性磷酸酶的活性以促進(jìn)骨的形成［16］。然而，由于BMP-2 在體內(nèi)半衰期較短和易被蛋白酶分解等因素，造成植體周圍藥物濃度不足，而不能發(fā)揮其誘導(dǎo)成骨的作用，所以會造成藥物的浪費(fèi)［17-18］。因此，構(gòu)建一種既能生長于鈦金屬表面，又能以適宜的濃度和速率穩(wěn)定釋放BMP-2 的載藥系統(tǒng)對提高植體的早期成功率具有積極的作用。

介孔氧化硅是一種孔徑大小可以在2～50 nm 范圍內(nèi)精確調(diào)控的新型納米材料［19-24］。其靈巧、多變的合成方式使之可完美地生長于眾多基底（金屬、非金屬）表面；高的比表面積、大的孔徑可使之具有更高的載藥量；可調(diào)的表面性質(zhì)可實(shí)現(xiàn)藥物分子的選擇性吸附；剛性結(jié)構(gòu)的介孔骨架可為客體分子提供保護(hù)支撐；低生物毒性以及生物可降解性可使之具有更好的生物相容性；表面存在的大量羥基基團(tuán)使之具有多變的后修飾潛力，進(jìn)而可實(shí)現(xiàn)藥物的可控負(fù)載以及釋放［25-27］。這些特性使基于介孔氧化硅的納米藥物輸送體系成為眾多科研工作者的研究熱點(diǎn)。

然而，迄今為止，將介孔氧化硅材料應(yīng)用于種植體表面處理的相關(guān)報道很少。若能將此新型材料生長于鈦金屬種植體表面，并負(fù)載BMP-2，在植體的局部形成一個緩釋藥物分子的微環(huán)境，將為促進(jìn)種植體早期發(fā)生骨結(jié)合、縮短臨床一期愈合時間提供有利條件。因此，本研究旨在構(gòu)建可緩釋BMP-2 的鈦金屬表面介孔氧化硅薄膜（mesoporous silica membranes on titanium substrates，Ti@mSiO2）載藥系統(tǒng)，為促進(jìn)種植體早期骨結(jié)合提供適宜的生物材料。

1 材料與方法

1.1 載藥系統(tǒng)的制備 采用油水兩相反應(yīng)法合成薄膜，其中將鈦箔作為生長基底。典型的反應(yīng)過程如下：8 ml 25 wt % 十六烷基三甲基氯化銨溶液（CTAC）（Sigma-Aldrich，美國）和0.075 ml 三乙醇胺（TEA）（Sigma-Aldrich，美國）先后加入到12 ml 去離子水中，并置于50 ml的圓底燒瓶中，加入一片鈦箔片（1.5 cm×1.5 cm），在60 ℃油浴中溫和地攪拌1 h后，加入7 ml濃度為10%的正硅酸四乙酯（TEOS）-環(huán)己烷（中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）溶液，從而形成了油水兩相體系，并繼續(xù)反應(yīng)120 min。反應(yīng)結(jié)束后，取出鈦箔片，用水和乙醇分別洗3 次，得到as-made介孔薄膜。通過在馬弗爐中600 ℃條件下焙燒3 h 得到介孔氧化硅薄膜，命名為Ti@mSiO2。

1.2 材料表征的觀察與元素分析 使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM）對載藥系統(tǒng)Ti@mSiO2表面介孔孔道進(jìn)行觀察；使用X 射線能譜儀（EDS）分析載藥系統(tǒng)Ti@mSiO2及Ti@mSiO2@BMP-2 表面元素成分，其能譜數(shù)據(jù)由配置牛津能譜儀的S-4800 FE-SEM 測得，工作電壓為1 kV，工作電流10 μA。

1.3 Ti@mSiO2對BMP-2 的負(fù)載量 BMP-2 用純水配制成1.0 μg/ml 的溶液。以吸附動力學(xué)實(shí)驗(yàn)為例，研究不同吸附時間對BMP-2 吸附量的影響，其步驟如下：將同樣大?。?.5 cm×1.5 cm）的鈦片及Ti@mSiO2片各10 片，分別浸入到裝有2.5 ml BMP-2 溶液（1.0 μg/L）的稱量瓶（30×50 mm）中，并在25 ℃環(huán)境中搖動。在每一個設(shè)好的時間點(diǎn)分別取出一片鈦片，瓶中剩余的BMP-2 濃度由紫外-可見光分光儀測量，并對比線性方程計算得出吸附量，即負(fù)載量。其他對比試驗(yàn)均在相同條件下進(jìn)行。

吸附平衡：介孔薄膜對BMP-2 分子的吸附率（即負(fù)載率）（P）可以由公式：P＝［（C0－Ct）/C0］×100%計算得到。其中，C0與Ct分別表示溶液的初始濃度與吸附時間為t時的濃度（單位μg/cm3）。

介孔薄膜對BMP-2 的吸附量（即負(fù)載量）由公式：Qe＝（C0－Ce）×V/S計算推得。Ce代表溶液吸附平衡時的濃度（μg/cm3），S代表介孔薄膜的面積（～4.5 cm2），V代表溶液的體積（2.5 ml），Qe代表該條件下平衡時的吸附量（μg/cm3）。

1.4 Ti@mSiO2載藥系統(tǒng)的藥物釋放 將同樣大?。?.5 cm×1.5 cm）的鈦片及Ti@mSiO2片各12 片，分別稱取15 μg BMP-2 用純水配制成溶液后滴至鈦及Ti@mSiO2片上，在常溫下（25 ℃）真空干燥。再將鈦片分別浸入到裝有2.5 ml PBS 的帶蓋燒杯中，置于37 ℃恒溫水浴箱中避光振蕩。在每一個設(shè)好的時間點(diǎn)分別取出一片鈦片，瓶中剩余的BMP-2 濃度由紫外-可見光分光儀測量（280 nm），并對比線性方程計算得出釋放量。其他對比試驗(yàn)均在相同條件下進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 載藥系統(tǒng)Ti@mSiO2的表征 FE-SEM 照片清晰地顯示出反應(yīng)前后鈦金屬表面的變化（圖1）。放大的SEM照片顯示鈦金屬表面非常粗糙（圖1B），有很多的棒狀條，棒狀條之間有非常明顯的孔洞，這非常有利于植體與動物或人體有機(jī)體的親和。經(jīng)過反應(yīng)后，介孔氧化硅薄膜生長于這些棒狀條的表面（圖1D），并且僅有極薄的厚度，保留與鈦箔表面完全相同的形狀，說明本工作所研發(fā)的介孔薄膜可靈活生長于鈦金屬材料表面，不會改變材料本身的基本框架，未來也可以通過改變鈦金屬的尺寸與形狀，得到相同形貌的薄膜材料，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)器件化的定制。

圖1 不同放大倍數(shù)下的鈦箔掃描電子顯微鏡（SEM）照片（A、B）和生長介孔氧化硅薄膜的鈦箔SEM照片（C、D）

此外，介孔薄膜在大的范圍內(nèi)是連續(xù)、光滑、無裂痕的。高倍電鏡照片顯示膜表面由～10 nm大小的介孔排列而成，沒有發(fā)現(xiàn)條形介孔孔道，表明了垂直導(dǎo)向介孔的存在［28-31］。以上結(jié)果充分證明具有垂直孔道氧化硅薄膜成功生長于鈦金屬表面。

圖2 顯示了Ti@mSiO2的一個片層區(qū)域SEM 照片以及區(qū)域?qū)?yīng)的Ti、硅（Si）、氧（O）三種元素的面掃描譜圖，結(jié)果表明Ti@mSiO2表面有非常明顯的Si 和O 元素含量，且Si和O 元素均勻分散于Ti金屬表面，進(jìn)一步說明介孔氧化硅薄膜成功地均勻生長于鈦金屬微觀表面。

圖2 鈦金屬表面介孔氧化硅薄膜（Ti@mSiO2）的掃描電子顯微鏡（SEM）照片（A）以及相應(yīng)區(qū)域的鈦（Ti）、硅（Si）、氧（O）三種元素的面掃面圖（B、C、D）

2.2 載藥系統(tǒng)Ti@mSiO2對BMP-2 的負(fù)載 在載藥系統(tǒng)Ti@mSiO2的載藥實(shí)驗(yàn)中，BMP-2作為一種大分子量的蛋白質(zhì)被選為客體分子。SEM 照片以及對應(yīng)區(qū)域的元素的面掃描圖（圖3）顯示，經(jīng)過自然吸附后，相較于Ti@mSiO2，其表面元素增加了大量的碳（C）和氮（N）元素，說明Ti@mSiO2成功吸附了大量的BMP-2蛋白。

圖3 Ti@mSiO2@BMP-2 的SEM 照片（A）以及相應(yīng)區(qū)域的Ti、O、Si、C、N 五種元素的面掃面圖（B～F）

在吸附動力學(xué)方面，由已知配置的BMP-2 初始濃度（0.1～10.0 mg/L）與相應(yīng)的紫外-可見光吸收光譜作圖，其特征吸收峰分別位于為280 nm，且峰值大小與溶液濃度呈線性關(guān)系，將數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行線性回歸分析得到線性擬合的回歸方程：f（x）=0.016+0.014x（圖4A），BMP-2 的吸附量根據(jù)此方程計算得出。測試結(jié)果顯示，在20 min 的時間內(nèi)，鈦箔對BMP-2 的吸附就已經(jīng)達(dá)到最大值，大約是0.019 μg/cm2（圖4B），說明這是一個比較快速的吸附過程。之后隨著吸附時間的增加，其吸附量并沒有明顯的增加，說明在20 min 時已經(jīng)達(dá)到了吸附的平衡狀態(tài)。相比之下，Ti@mSiO2的吸附效率有了更大的提高，盡管介孔氧化硅薄膜在鈦箔的表面只有薄薄的一層，但是其吸附量高達(dá)0.206 μg/cm2，大約是純鈦金屬的10.5 倍。其良好的吸附性能主要?dú)w因于以下3 點(diǎn)：（1）介孔氧化硅薄膜具有超薄的厚度，因此為BMP-2 分子的擴(kuò)散以及與介孔表面的相互作用提供了超短的擴(kuò)散路徑；（2）介孔氧化硅薄膜的孔道是垂直開放式的，由于BMP-2 分子更接近于線性或平面的構(gòu)型，垂直開放的直型孔道更能促進(jìn)它的密堆積；（3）介孔氧化硅薄膜有一個大的孔徑（～10 nm），該孔徑遠(yuǎn)大于BMP-2 分子的大小，這對于BMP-2 分子的擴(kuò)散和傳輸來說沒有明顯的空間阻礙，因此有利于BMP-2 分子吸附到內(nèi)部的介孔表面［28-31］。

圖4 BMP-2 的紫外-可見光吸收光譜與濃度（0.1～10.0 mg/L）之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線（A）；鈦（Ti）箔以及Ti@mSiO2對BMP-2吸附效率隨時間變化的曲線（BMP-2溶液初始濃度為1.0 mg/L）（B）

2.3 Ti@mSiO2載藥系統(tǒng)對BMP-2 的緩釋效果 在BMP-2 分子的釋放性能測試中，鈦以及Ti@mSiO2分別負(fù)載等量的BMP-2（15 μg）。為模擬種植體環(huán)境，采用靜態(tài)釋放方法（圖5A）。圖5B 顯示，在靜態(tài)溶液中，鈦箔負(fù)載的BMP-2可以在3 h內(nèi)完全釋放，表現(xiàn)出一個非?？斓尼尫胚^程。形成鮮明對比的是，Ti@mSiO2的釋放速度很慢，需要72 h才能完全釋放，緩釋效果提高了23倍，說明介孔結(jié)構(gòu)的存在有效提升了體系的緩釋效果，這主要?dú)w功于以下2 點(diǎn)：（1）具有開放介孔孔道的氧化硅薄膜為BMP-2 分子提供了更大的納米級存儲空間，從而減小了BMP-2 分子與水分子在靜態(tài)條件下的接觸面積，提高了BMP-2的控釋性能；（2）介孔孔道的毛細(xì)管作用力、介孔氧化硅與BMP-2 分子之間的氫鍵作用力都有效減緩了BMP-2 分子從介孔中釋放的速度。以上結(jié)果說明，介孔薄膜的存在有助于提高載藥系統(tǒng)的緩釋效果［31］。

圖5 BMP-2 從載藥系統(tǒng)緩釋的實(shí)驗(yàn)過程（A）；Ti@mSiO2載藥系統(tǒng)對比純鈦（Ti）緩釋時間曲線（B）；BMP-2 分子從載藥系統(tǒng)Ti@mSiO2（左）與鈦片（右）中釋放效果示意圖（C）

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用油水兩相法，成功在鈦金屬表面制備出具有垂直開放孔道的介孔氧化硅薄膜。Ti@mSiO2具有完整的厘米尺度上的形態(tài)、超薄的厚度、隨金屬表面微觀結(jié)構(gòu)而改變的特性，因此賦予它作為藥物載體的良好條件。Ti@mSiO2相較于純鈦，其對BMP-2 具有高達(dá)0.206 μg/cm2的負(fù)載量。這主要?dú)w功于介孔氧化硅薄膜所特有的優(yōu)點(diǎn)：一是Ti@mSiO2超大的比表面積提供了大量羥基官能團(tuán)，這些羥基官能團(tuán)通過氫鍵顯著提高它們與更多BMP-2分子的親和力；二是垂直的介孔結(jié)構(gòu)有利于BMP-2 分子在較少空間障礙的情況下，自由地向介孔內(nèi)部遷移和擴(kuò)散；三是垂直介孔的低界面曲率與BMP-2 分子的平面形狀非常吻合，這樣就方便了它們的緊密聚積。本實(shí)驗(yàn)利用介孔氧化硅薄膜直接吸附BMP-2，負(fù)載過程簡單，不會破壞生長因子的活性。同時，Ti@mSiO2載藥系統(tǒng)的藥物緩釋效果明顯，釋放時間延長到72 h，是純鈦片的24倍，這同樣歸功于介孔氧化硅薄膜介孔孔道對BMP-2 分子的阻隔作用和氫鍵作用力。

綜上所述，Ti@mSiO2可有效負(fù)載、緩釋BMP-2分子，是較為理想的載藥系統(tǒng)，本課題組未來將從細(xì)胞層面上研究此載藥系統(tǒng)對骨結(jié)合的促進(jìn)作用。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。