吳紅芳 張冬云 張海燕 吳勤祥 魏嚴 王靜 張云霞

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,河南 南陽 473000;2 第一附屬醫(yī)院病理科;3 第一附屬醫(yī)院普外科）

免疫細胞與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移具有緊密的相關(guān)性，其中自然殺傷（NK）細胞在免疫監(jiān)視中起重要作用，且其通常被公認為抗腫瘤免疫的有益細胞群〔1〕。NK 細胞的消耗可導(dǎo)致循環(huán)腫瘤細胞存活數(shù)量的增加，誘導(dǎo)癌癥的進一步惡化〔2～5〕。據(jù)報道，免疫細胞在結(jié)直腸癌、胃癌、食管癌中均具有調(diào)控作用〔6〕。白細胞介素（IL）-2 和IL-27 是普通γ 鏈細胞因子家族的一員，由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能，已引起研究者的廣泛關(guān)注。輔助性T 細胞（TH）、濾泡性輔助性T 細胞（TFH）、Th2 和自然殺傷性T 細胞（NKT）均可產(chǎn)生IL-2、IL-27〔7，8〕。本研究將通過觀察IL-2 與IL-27 對NK 細胞的分化及抗結(jié)直腸癌能力的影響，揭示其影響NK 細胞殺傷結(jié)腸癌細胞功能的作用及機制，為結(jié)直腸癌的細胞免疫治療的探索提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細胞HCT116 購自ATCC；外周血細胞來自南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院確診并經(jīng)放化療治療的結(jié)直腸癌患者10 例，患者及家屬均簽署知情同意書。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、CCK-8 試劑、胰蛋白酶均購自美國Sellect 公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒購自大連Takara公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜購自德國羅氏公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）試劑盒、電化學(xué)發(fā)光（ECL）液和RIPA 蛋白裂解液均購自碧云天生物技術(shù)公司；鼠抗人單克隆抗體腫瘤壞死因子（TNF）-α 和TNF-β、山羊抗鼠免疫球蛋白（Ig）G、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的鼠抗人CD3 單克隆抗體，腫瘤組織腺瘤樣息肉蛋白（APC）標記鼠抗人CD16 單克隆抗體，PE 標記的鼠抗人CD56 單克隆抗體及同型對照單克隆抗體（FITC IgG2b，APC IgG2a，PE IgG2a）均購自美國EB 公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將結(jié)直腸癌細胞HCT116 用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長至融合度75%左右，用胰蛋白酶消化約1 min，按照1 ∶3的比例更換培養(yǎng)基，每2 d 傳代一次。

1.3 流式細胞術(shù)檢測及分選CD3-、CD16+、CD56+NK 細胞、NK 細胞 按照Ficoll 的力度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC），將其標記為Before culture 組。將PBMC 置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d 更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)14 d，標記為After culture 組，空白對照標記為Untreated 組，用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細胞，依次加入抗體（D3-FITC，CD16-APC，CD56-PE），最后通過流式細胞儀檢測、分選CD3-、CD16+、CD56+NK 細胞、NK 細胞。將IL-2、IL-27、IL-2 聯(lián)合IL-27 培養(yǎng)的PBMC 標記為IL-2組、IL-27 組、IL-2+IL-27 組。將其進行常規(guī)培養(yǎng)14 d，按照上述方法用流式細胞術(shù)進行檢測、分選CD3-、CD16+、CD56+NK 細胞、NK 細胞。

1.4 CCK-8 法檢測NK 細胞對結(jié)直腸癌細胞的殺傷作用 調(diào)整結(jié)直腸癌細胞HCT116 至105個/ml。將IL-2 組、IL-27 組、IL-2+IL-27 組分化的CD3-、CD16+、CD56+NK 細胞、NK 細胞作為效應(yīng)細胞，再加入靶細胞孵育24 h。按照效應(yīng)細胞∶靶細胞（E ∶T）20 ∶1、10 ∶1、5 ∶1的比例加入效應(yīng)細胞，培養(yǎng)4 h，再加入CCK-8（20 μl），在450 nm 波長下檢測細胞的吸光值（OD）。NK 細胞對結(jié)直腸癌細胞HCT116的殺傷率=〔1-（OD 效應(yīng)細胞/OD 對照細胞）〕×100%。

1.5 Western 印跡檢測NK 細胞中TNF-α、TNF-β的蛋白表達 RIPA 蛋白裂解液對對數(shù)期細胞進行冰上蛋白裂解1 h，提取總蛋白，以BCA 法測定樣品蛋白的濃度。以4 ∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水浴變性5 min，離心取上清，取60 μg 目的蛋白、蛋白Marker 進行SDS-PAGE。然后將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST 洗滌，4℃條件下，將封閉后的PVDF 膜放入1 ∶1 000倍稀釋的一抗（鼠抗人單克隆抗體TNF-α、TNF-β）中反應(yīng)過夜，以封閉液洗膜3 次，每次5 min，再在37℃下將PVDF 膜轉(zhuǎn)入1 ∶2 000 倍稀釋的二抗（山羊抗鼠IgG）中反應(yīng)2 h。于暗室內(nèi)ECL 試劑盒顯影曝光:滴加化學(xué)發(fā)光劑顯影，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。Qμantity One 4.62 圖像分析軟件進行條帶灰度分析，Image J 分析目的條帶的灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，以目的條帶灰度值與β-actin 灰度值的比值表示目的蛋白的表達情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0 軟件進行分析。所有試驗進行3 個平行實驗，實驗重復(fù)3 次。計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)前后對NK 細胞水平的影響 與Before culture 組相比，After culture 組細胞中CD3-、CD16+、CD56+NK、NK 細胞的分化率均顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 流式檢測NK 細胞CD3-、CD16+、CD56+、NK細胞的比例(,n=9,%)

表1 流式檢測NK 細胞CD3-、CD16+、CD56+、NK細胞的比例(,n=9,%)

2.2 IL-2 聯(lián)合IL-27 對NK 細胞增殖無影響 Untreated 組、IL-2 組、IL-27 組、IL-2+IL-27 組PMBC 中CD3-CD56+NK 細胞的表達率均無顯著性差異。見表2。

表2 IL-2 聯(lián)合IL-27 對CD3-CD56+NK細胞陽性率及NKG2D 受體表達的影響(,n=9)

表2 IL-2 聯(lián)合IL-27 對CD3-CD56+NK細胞陽性率及NKG2D 受體表達的影響(,n=9)

與Untreated 組比較:1）P＜0.05；與IL-2 組比較:2）P＜0.05；與IL-27 組相比較:3）P＜0.05

2.3 IL-2 聯(lián)合IL-27 誘導(dǎo)促進NK 細胞表面NKG2D 受體的表達 與Untreated 組相比，IL-2 組、IL-27 組PMBC 中NKG2D 表達率均顯著升高；與IL-2 組或IL-27 組相比，IL-2+IL-27 組PMBC 中NKG2D表達率均顯著升高（P＜0.05）。見表2。

2.4 IL-2 聯(lián)合IL-27 誘導(dǎo)增強NK 細胞對結(jié)腸癌細胞的殺傷作用 與Untreated 組相比，IL-2 組、IL-27組PMBC 中E ∶T=10 ∶1、E ∶T=20 ∶1所占比率均顯著升高；與IL-2 組或IL-27 組相比，IL-2+IL-27 組PMBC 中E ∶T=10 ∶1、E ∶T=20 ∶1所占比率均顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 NK 細胞對結(jié)腸癌細胞的殺傷作用(,n=9,%)

表3 NK 細胞對結(jié)腸癌細胞的殺傷作用(,n=9,%)

2.5 IL-2 聯(lián)合IL-27 誘導(dǎo)增強NK 細胞中TNF-α和TNF-β 的表達 與Untreated 組相比，IL-2 組、IL-27 組TNF-α 和TNF-β 表達均顯著升高；與IL-2 組或IL-27 組相比，IL-2+IL-27 組TNF-α 和TNF-β 表達均顯著升高（P＜0.05）。見表4、圖1。

圖1 Western 印跡檢測NK 細胞中TNF-α 和TNF-β 的表達

表4 IL-2 聯(lián)合IL-27 誘導(dǎo)增強NK 細胞TNF-α 和TNF-β 的分泌(,n=9)

3 討論

NK 細胞在針對腫瘤和病毒感染細胞的先天免疫中起主要作用。據(jù)報道〔9，10〕，IL-2 刺激對小鼠中NK 細胞抑制性受體Ly49A 的表達明顯增加，但對NK 細胞激活性受體Ly49C 和Ly49D 的表達沒有變化，且IL-2 刺激增加了NK 細胞群和活化標記NK1.1 的表達，并不引起NK 細胞的過度增殖、巨噬細胞炎癥蛋白（MIP）-1α 和γ 干擾素（IFN-γ）的增加，暗示了一種與IL-2 組合療法結(jié)合的免疫療法的新思路。Dondero 等〔11〕發(fā)現(xiàn)，IL-27 未表現(xiàn)出促血管生成的特性，卻具有上調(diào)程序性死亡受體-配體（PDL）2 和淋巴細胞抗原（HLA）-1 在腫瘤內(nèi)皮表達的能力。IL-2 和IL-27 對NK 細胞及腫瘤的影響未曾有明確的益處，但是IL-2 聯(lián)合IL-27 對腫瘤患者是否具有積極的影響目前尚且未知。武海英等〔12〕在研究中發(fā)現(xiàn)，IL-21 聯(lián)合IL-21 可上調(diào)NK 細胞的增殖能力和NKG2D 的表達，增強患者的自然免疫屏障功能。因此，推測IL-2 聯(lián)合IL-27 可能對NK 殺傷結(jié)直腸癌細胞具有益處。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-2 聯(lián)合IL-27 可增強結(jié)直腸癌患者外周血中CD3-、CD16+、CD56+、NK 的細胞的分化率，上調(diào)NK 細胞表面NKG2D 受體的表達，這與前人〔12〕關(guān)于IL-2、IL-27對NK 細胞的作用均相吻合，這也說明了IL-21 聯(lián)合IL-21 可促進NK 細胞的分化及NKG2D 受體表達的功能，為探索IL-2 聯(lián)合IL-27 在結(jié)直腸癌中的潛在治療價值提供參考依據(jù)；有趣的是，IL-2 聯(lián)合IL-27對NK 細胞的增殖無明顯的影響，但其機制仍未清楚。

近些年，腫瘤的免疫治療成為繼常規(guī)的手術(shù)、放化療之后的新興的治療方法，其具有自身獨特的優(yōu)勢。免疫治療是基于機體最基礎(chǔ)的先天免疫展開的一種增強免疫力的抗癌方法〔13，14〕。NK 細胞為機體先天免疫的淋巴細胞，參與抗腫瘤、抗感染等保護功能〔15〕。據(jù)報道，NK 細胞參與抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，同 時也發(fā) 生機體 的免疫逃 避〔16，17〕。Coca等〔18〕、Ishigami 等〔19〕在結(jié)直腸癌、胃癌的研究中報道，NK 細胞有益于患者病情的轉(zhuǎn)歸。Shimaoka等〔20〕在研究中發(fā)現(xiàn)，抗小鼠IL-6 受體抗體（MR16-1）相較于細胞因子的免疫抑制劑托法替尼對結(jié)腸癌小鼠具有明顯的增強NK 細胞的增殖和分化及抑制結(jié)腸癌小鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢，提示NK 細胞在抗腫瘤中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-2 聯(lián)合IL-27可增強NK 細胞對結(jié)腸癌細胞的殺傷作用，揭示了IL-2 和IL-27 聯(lián)合通過增強NK 細胞殺傷力對結(jié)直腸癌發(fā)揮抑制作用，為開發(fā)結(jié)直腸癌的新藥提供新思路；深入研究，IL-2 聯(lián)合IL-27 可增強NK 細胞對結(jié)腸癌的殺傷能力，其機制與上調(diào)TNF 表達密切相關(guān)。