邢明遠(yuǎn) 賴志亨 馬萌

（海南省中醫(yī)院 1 腫瘤科,海南 ?？?570203;2 肛腸科;3 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科）

結(jié)腸癌原發(fā)于結(jié)腸黏膜上皮，惡性程度高，其是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，也是臨床上癌癥相關(guān)死亡的主要原因，且近幾年隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，快節(jié)奏的生活方式和不良的生活習(xí)慣，導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年提高，嚴(yán)重威脅人們的生命健康〔1～3〕。隨著對(duì)中醫(yī)學(xué)的深入研究，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)在臨床治療腫瘤中發(fā)揮重要作用，為臨床上治療腫瘤擴(kuò)展了新思路。蘿卜硫素又稱為菜菔子素，作為提取于十字花科蔬菜中的一種異硫氰酸酯類天然活性物質(zhì)，其能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅱ型解毒酶，從而調(diào)控癌細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程，防止乳腺癌等擴(kuò)散與蔓延〔4〕。Notch 信號(hào)通路在癌癥中受到廣泛關(guān)注，其能夠調(diào)控Hes1 等下游因子表達(dá)進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡等生理病理過(guò)程〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，Notch 信號(hào)通路與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔6〕，其中Notch1 在人結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞增殖受抑制同時(shí)，Notch1、Hes1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平亦顯著下調(diào)〔7〕。此外，楊正宏等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素能抑制結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞增殖、血管形成并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能與抑制Notch1 表達(dá)有關(guān)。本研究將以結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞為研究對(duì)象，基于Notch 信號(hào)通路探究蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響，以期為結(jié)腸癌治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞（貨號(hào):C4115，美國(guó)ATCC 公司），蘿卜硫素（≥98%，貨號(hào):BP0219，成都格純生物醫(yī)藥有限公司），胰酶溶液（貨號(hào):C0201，杭州碧云天生物研究所），胎牛血清（FBS）、RPMI1640 培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）試劑（貨號(hào):KL-NXQ05、KL-S764、KL-S0050，上?？道噬锟萍加邢薰荆?，兔抗人Notch1、Notch3、Hes1、β-actin 抗 體（貨 號(hào):K10957-JRY、K21355-RPK、K17548-MTX、K10085-OZI，北京百奧萊博科技有限公司），兔抗人Ki-67、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體（貨號(hào):FNab09788、FNab06217、FNab05247、FNab10112，武漢菲恩生物科技有限公司），山羊抗兔IgG（H+L）辣根過(guò)氧化物酶（HRP）（貨號(hào):BM3894，武漢博士德生物工程有限公司）。CO2培養(yǎng)箱（型號(hào):INC108，德國(guó)Heraeus 公司），流式細(xì)胞儀（型號(hào):FACSCanto Ⅱ，美國(guó)BD 公司），蛋白電泳及電轉(zhuǎn)移裝置（型號(hào):AU5800，北京市六一儀器廠），酶聯(lián)免疫分析儀（型號(hào):EVO75，澳大利亞Techan 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞接種于RPMI1640 培養(yǎng)液（RPMI1640 培養(yǎng)基中添加1%青鏈霉素雙抗和10% FBS）中，在37℃、5% CO2、98%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞的融合度達(dá)70%～80%時(shí)，胰酶溶液消化傳代，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 比色法篩選蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞的作用濃度 SW480 細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)/ml，隨后以每孔200 μl 接種到96 孔板上，常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜后棄培養(yǎng)液，加入含不同濃度蘿卜硫素〔終濃度分別為0（對(duì)照）、1、2、5、10、20、40 μmol/L〕的RPMI1640 培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后每孔添加25 μl MTT 溶液（5 mg/ml），再繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄上清液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜（DMSO）溶液，于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，最后用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)490 nm）測(cè)定各孔吸光度（OD 值），計(jì)算SW480 細(xì)胞增殖抑制率，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（OD 值對(duì)照組-OD 值實(shí)驗(yàn)組）/OD 值對(duì)照組×100%。

1.2.3 細(xì)胞分組及處理 將SW480 細(xì)胞分為對(duì)照組、低、中、高濃度組，其中對(duì)照組不進(jìn)行藥物處理，低、中、高濃度組分別采用1、2、5 μmol/L 蘿卜硫素處理。

1.2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)測(cè)定SW480 細(xì)胞集落形成能力 取對(duì)數(shù)期SW480 細(xì)胞，胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液，接種于6 孔板中，按照1.2.3 分組處理細(xì)胞，靜置培養(yǎng)2 w 后，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去上清液，甲醇固定、結(jié)晶紫染色，洗去染色液，洗滌后在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)≥50 的單克隆集落，計(jì)算集落形成率（表示SW480 細(xì)胞集落形成能力）。集落形成率（%）=集落數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.2.5 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定SW480 細(xì)胞侵襲能力 將200 μg/ml 基質(zhì)膠以200 μl/cm2鋪在Transwell 小室上室，待其凝固，備用。用RPMI1640 培養(yǎng)液（不含F(xiàn)BS）將SW480 細(xì)胞調(diào)整為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取200 μl 細(xì)胞懸液接種到Transwell 上室，600 μl 含10% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)液加入下室，待SW480 細(xì)胞貼壁后棄上清液，按照1.2.3 分組處理細(xì)胞（RPMI1640 培養(yǎng)液不含F(xiàn)BS），每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后取出Transwell 小室，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次后用棉球輕擦上室濾膜表面殘存細(xì)胞，在4℃下10%甲醛固定10 min，PBS 洗滌后室溫下0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS 再次洗滌。倒置顯微鏡下觀察染色細(xì)胞，隨機(jī)選擇6個(gè)視野計(jì)數(shù)（即侵襲細(xì)胞數(shù)，表示SW480 細(xì)胞侵襲能力），結(jié)果取平均值。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定SW480 細(xì)胞遷移能力 將SW480 細(xì)胞接種于6 孔板，當(dāng)其單層平鋪底部時(shí)，用滅菌后的200 μl 槍頭垂直于底部，均勻劃出一道劃痕，隨后用PBS 洗滌3 次，用倒置顯微鏡觀察劃痕并拍照（記錄為0 h 劃痕距離），接著按照1.2.3分組處理細(xì)胞（RPMI1640 培養(yǎng)液不含F(xiàn)BS），每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞劃痕情況并拍照（記錄為48 h 劃痕距離），計(jì)算劃痕愈合率（表示SW480 細(xì)胞遷移能力）。劃痕愈合率（%）=（0 h 劃痕距離-48 h 劃痕距離）/0 h劃痕距離×100%。

1.2.7 Western 印跡法測(cè)定SW480 細(xì)胞中Notch 通路相關(guān)蛋白、增殖相關(guān)蛋白及遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)水平 將SW480 細(xì)胞接種于6 孔板，按照1.2.3分組處理細(xì)胞48 h 后收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液充分裂解后離心，以提取各組SW480 細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定蛋白濃度。各組取50 μg 蛋白上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5% BSA 室溫封閉1 h 后加入兔抗人Notch1、Notch3、Hes1、Ki-67、PCNA、MMP-9、E-cadherin 及內(nèi)參β-actin 抗體（稀釋比例均為1 ∶1 000）作為一抗，4℃孵育過(guò)夜，PBS 洗滌3 次后加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（稀釋比例1 ∶1 000）作為二抗，室溫孵育30 min，PBS 洗滌后ECL 顯色，Tanon 凝膠分析系統(tǒng)掃描圖像，分析各條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞作用濃度的篩選結(jié)果 與0 μmol/L 蘿卜硫素處理SW480 細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制率〔（2.01±0.91）%〕相比，1、2、5、10、20、40 μmol/L 蘿卜硫素處理SW480 細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制 率〔（7.29 ± 2.06）%，（13.09 ± 4.28）%，（27.18±4.54）%，（37.98 ± 5.91）%，（55.84 ±7.53）%，（79.85±8.54）%〕均顯著升高，并呈濃度依賴性（均P＜0.05）。當(dāng)蘿卜硫素濃度≤5 μmol/L時(shí)，作用48 h后SW480 細(xì)胞增殖抑制率均＜30%，即此時(shí)細(xì)胞相對(duì)活力＞70%，故選取蘿卜硫素濃度為1、2、5 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以防止細(xì)胞活力過(guò)低影響Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2 蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞集落形成能力的影響 與對(duì)照組SW480 細(xì)胞集落形成率〔（77.16 ±6.14）%〕相比，低、中、高濃度組〔（63.04 ±4.98）%，（51.18±6.79）%，（39.44±6.08）%〕顯著降低；且呈濃度依賴性（均P＜0.05）。見圖1。

圖1 蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞集落形成能力的影響(結(jié)晶紫染色,×40)

2.3 蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞侵襲能力的影響 與對(duì)照組SW480 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)〔（85.26±9.19）個(gè)〕相比，低、中、高濃度組〔（69.09±8.95）個(gè)，（53.68±7.78）個(gè)，（39.94±6.26）個(gè)〕顯著減少且呈濃度依賴性（P＜0.05）。見圖2。

圖2 蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

2.4 蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞遷移能力的影響 與對(duì)照組 SW480 細(xì) 胞劃痕愈 合率〔（94.47 ±10.56）%〕 相 比，低、中、高濃度 組〔（76.48 ±9.17）%，（61.17±9.69）%，（42.85±7.46）%〕顯著降低，且呈濃度依賴性（均P＜0.05）。見圖3。

圖3 蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞遷移能力的影響(×100)

2.5 蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞中Notch 通路的影響 與對(duì)照組相比，低、中、高濃度組SW480 細(xì)胞中Notch 通路相關(guān)蛋白Notch1、Notch3、Hes1 相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，且呈濃度依賴性（均P＜0.05）。見表1，圖4。

表1 蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞中Notch 通路、Ki-67、PCNA、MMP-9、E-cadherin 蛋白表達(dá)的影響(,n=6)

表1 蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞中Notch 通路、Ki-67、PCNA、MMP-9、E-cadherin 蛋白表達(dá)的影響(,n=6)

與對(duì)照組比較:1）P＜0.05；與低濃度組比較:2）P＜0.05；與中濃度組比較:3）P＜0.05

圖4 蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞中Notch 通路的影響

2.6 蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞中增殖及遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，低、中、高濃度組SW480 細(xì)胞中Ki-67、PCNA、MMP-9 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，E-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，且均呈濃度依賴性（均P＜0.05）。見表1，圖5。

圖5 蘿卜硫素對(duì)SW480 細(xì)胞中Ki-67、PCNA、MMP-9、E-cadherin 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率仍呈逐年上升趨勢(shì)，手術(shù)切除、放療、化療、生物治療或分子靶向治療是其常用臨床治療方式，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步、綜合治療的發(fā)展，結(jié)腸癌患者的預(yù)后雖有一定程度改善，但腫瘤浸潤(rùn)深或有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者生存率仍較低，且放療、化療副作用大，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量〔9，10〕。

研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素能夠抑制人結(jié)腸癌HT-9細(xì)胞、SW620 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，且抑制SW620 細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與其降低MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)有關(guān)〔11，12〕。顧文燕等〔13〕發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素可通過(guò)上調(diào)Bax 表達(dá)促使結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對(duì)癌細(xì)胞化療耐受的能力。本研究結(jié)果提示在1～40 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，蘿卜硫素能顯著抑制SW480 細(xì)胞增殖，能呈濃度依賴性降低SW480 細(xì)胞集落形成、侵襲、遷移能力。Ki-67、PCNA 均與細(xì)胞增殖活性相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤組織細(xì)胞中PCNA、Ki-67 的表達(dá)，可抑制移植瘤細(xì)胞增殖〔14〕；MMP 能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移，研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)MMP-9 表達(dá)能夠顯著抑制結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞的遷移和侵襲能力〔15〕；E-cadherin 作為一種鈣依賴性黏附分子，其表達(dá)缺失可降低細(xì)胞黏附能力、增強(qiáng)其分散能力，研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移受抑制可能與上調(diào)E-cadherin 表達(dá)相關(guān)〔16〕。本研究結(jié)果提示蘿卜硫素能夠通過(guò)下調(diào)Ki-67、PCNA、MMP-9 蛋白表達(dá)，上調(diào)E-cadherin 蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制SW480 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，與既往研究結(jié)果類似〔14～16〕。

Notch 信號(hào)通路作為高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其異常激活與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)該通路存在Notch1、Notch2、Notch3、Notch4 4 個(gè)受體，Hes1 為其常見的經(jīng)典下游基因。研究表明，抑制過(guò)度激活的Notch1/Hes1 信號(hào)通路可抑制HT29 和HCT116 細(xì)胞等結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)〔17〕。高蕊等〔7〕在SW480 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，蘆丁可以通過(guò)抑制Notch1 與Hes1 介導(dǎo)的細(xì)胞增殖分化途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)腸癌的治療作用。Wang 等〔18〕發(fā)現(xiàn)MicroRNA-206 可通過(guò)靶向下調(diào)Notch3 表達(dá)，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌SW480 和SW620 細(xì)胞增殖和遷移。本研究結(jié)果提示蘿卜硫素能明顯抑制Notch 信號(hào)通路相關(guān)受體Notch1、Notch3 及下游基因Hes-1 蛋白表達(dá)，抑制Notch 信號(hào)通路激活。