馬新蘋 黨長林

（1 新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院皮膚性病科,河南 新鄉(xiāng) 453000;2 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院成人康復(fù)科）

瘢痕疙瘩是一種良性皮膚腫瘤，以成纖維細(xì)胞的過度增殖、膠原蛋白和纖連蛋白的過量沉積為特征，是創(chuàng)傷愈合最常見的病理形式〔1〕。其發(fā)生發(fā)展不僅影響皮膚美觀，常伴有疼痛、瘙癢癥狀，甚至造成嚴(yán)重的功能損害，對患者危害極大。此外，瘢痕疙瘩術(shù)后復(fù)發(fā)率高，術(shù)后畸形較多，單純手術(shù)切除難以治愈〔2，3〕。白芍是臨床常用中草藥之一，具有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗等功效。白芍總苷（TGP）是白芍的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和鎮(zhèn)痛作用。此外，TGP 通過調(diào)控滑膜成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡對骨關(guān)節(jié)炎具有治療作用〔4〕。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）是絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號通路的一部分，研究顯示〔5，6〕，ERK 的磷酸化調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞分化，ERK 通路的異常激活與病理性瘢痕的形成有關(guān)。但TGP 能否通過調(diào)控ERK 信號通路進(jìn)而影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡尚未可知。目前，尚未見TGP 與瘢痕疙瘩的相關(guān)報道。本研究觀察不同濃度的TGP 對體外培養(yǎng)的人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（HKF）增殖、纖維化、凋亡及ERK 信號通路的影響，探索其分子機(jī)制，為瘢痕疙瘩的治療開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料 HKF 購于中科院上海細(xì)胞庫；（DMEM）培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco 公司；TGP（純度≥98%）購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；MAPK/ERK 信號通路激活劑（ISO）購于MEC 公司；噻唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞增殖檢測試劑盒和膜聯(lián)蛋白異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司；Western 封閉液、Western 洗滌液、放射免疫沉淀測定（RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒購于上海碧云天公司；鼠源Ⅰ型膠原蛋白α1鏈（Col1A1）單克隆抗體和鼠源Col3A1 單克隆抗體購于Santa Cruz 公司；兔源α-平滑肌肌動蛋白（SMA）多克隆抗體、兔源B 細(xì)胞淋巴瘤（Bcl）-2 單克隆抗體、兔源Bcl 相關(guān)X 蛋白（Bax）多克隆抗體、兔源Caspase-3 多克隆抗體、鼠源ERK1/2 單克隆抗體購于Abcam 公司；兔源p-ERK1/2 多克隆抗體購于Invitrogen 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠和羊抗兔Ⅱ抗購于武漢博士德公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 采用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在37℃，含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HKF，每隔2 d 換液1 次，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，即傳代培養(yǎng)，取3～5 代對數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗。細(xì)胞分組為對照組:不用TGP 處理；實(shí)驗組:分別用含5、10、20、40、80 μmol/L TGP 濃度的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。為進(jìn)一步證實(shí)TGP 是通過調(diào)控ERK 信號通路進(jìn)而調(diào)控HKF 的增殖和凋亡，使用40 μmol/L TGP 處理HKF 后，加入ISO（20 μmol/L）〔7〕，檢測細(xì)胞的增殖、凋亡和纖維化情況。

1.3 MTT 法檢測細(xì)胞增殖活力 將HKF 按照每孔1×104個細(xì)胞數(shù)接種于96 孔板過夜，用不含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，以含5、10、20、40、80 μmol/L 濃度梯度的TGP 的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每組濃度加入設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置對照組（不加TGP）分別在培養(yǎng)24、48、72 h 時間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。向每孔內(nèi)加入20 μl 的MTT（5 g/L）溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，再向每孔加入150 μl 二甲基亞砜（DMSO），搖床振蕩10 min，當(dāng)結(jié)晶物充分溶解后，在酶標(biāo)儀上測490 nm 波長處各孔的吸光度值（用空白孔調(diào)零），計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗組平均OD 值/對照組平均OD 值×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將HKF 按照每孔1×104個細(xì)胞數(shù)接種于96 孔板過夜，用不含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，用含10、20、40 μmol/L 的TGP 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每組濃度加入設(shè)置3 個復(fù)孔，同時設(shè)置對照組（不加TGP）。48 h 后，收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，隨后用1×結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞，離心后棄上清。加入適量的1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，取100 μl 細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)約為1×105個）加入流式管，隨后加入5 μl Annexin V-FITC，混勻后避光孵育10 min，加入5 μl PI，繼續(xù)孵育5 min 后，補(bǔ)加PBS 液至500 μl，混勻后1 h 內(nèi)上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5 Western 印跡檢測 采用Western 印跡檢測各組HKF 纖維化相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白、ERK 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。用RIPA 裂解法提取各組對數(shù)期細(xì)胞的總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg 細(xì)胞蛋白，煮沸3 min 使其充分變性后，上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）加樣孔及耐性電泳，電泳結(jié)束后，將已分離的細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，隨后用Western 封閉液室溫條件封閉1 h，Western 洗滌液洗膜后，加入已稀釋的一抗4℃孵育過夜，Western 洗滌液洗膜后，加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，再次用Western 洗滌液洗膜后，超敏電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，隨后以βactin 為內(nèi)參，利用Photoshop CS5 軟件分析條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TGP 對HKF 增殖的影響 不同濃度TGP 對HKF 分別作用24 h、48 h、72 h 后，較高濃度（20、40、80 μmol/L）的TGP 對HKF 增殖具有顯著的抑制作用，與同時間點(diǎn)對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著TGP 濃度的降低，對HKF 的抑制作用逐漸減弱，較低濃度（5 μmol/L）的TGP 對HKF 增殖具有輕度的促進(jìn)作用，且同一濃度下，隨著干預(yù)時間的延長抑制或促進(jìn)作用逐漸升高，呈時間依賴性。見表1。

表1 不同濃度TGP 對HKF 增殖的影響(,n=9)

表1 不同濃度TGP 對HKF 增殖的影響(,n=9)

與對照組比較:1）P＜0.05，表2，3 同

2.2 不同濃度TGP 對HKF 纖維化標(biāo)記表達(dá)的影響 與對 照組比較，10 μmol/L TGP 組 HKF Col1A1、Col3A1、α-SMA 表達(dá)水平無顯著變化（P＞0.05），20、40 μmol/L TGP 組HKF Col1A1、Col3A1、α-SMA 表達(dá)水平顯著降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 Western 印跡檢測HKF Col1A1、Col3A1 及α-SMA 的表達(dá)

2.3 不同濃度TGP 對HKF 凋亡的影響 10 μmol/L TGP 組HKF Bax、Caspase-3、Bcl-2 的表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率無顯著變化（P＞0.05）。20、40 μmol/L TGP 組HKF Bax 和Caspase-3 表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測HKF 凋亡和Western 印跡檢測Bax、Caspase-3 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)

表2 不同濃度TGP 對HKF Col1A1、Col3A1、α-SMA 及凋亡相關(guān)蛋白和凋亡率的影響(,n=9)

表2 不同濃度TGP 對HKF Col1A1、Col3A1、α-SMA 及凋亡相關(guān)蛋白和凋亡率的影響(,n=9)

2.4 不同濃度TGP 對HKF ERK 信號通路的影響 與對照組比較，10 μmol/L TGP 組HKF ERK 信號通路相關(guān)蛋白p-ERK1/2 和ERK1/2 的表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05），20、40 μmol/L TGP 組HKF ERK 信號通路相關(guān)蛋白p-ERK1/2 和ERK1/2 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。見圖3、表3。

圖3 Western 印跡檢測p-ERK1/2 和ERK1/2 蛋白的表達(dá)

表3 不同濃度TGP 對HKF ERK 信號通路的影響(,n=9)

表3 不同濃度TGP 對HKF ERK 信號通路的影響(,n=9)

2.5 ISO 逆轉(zhuǎn)TGP 對HKF 的增殖和凋亡的影響 與對照組比較，TGP 組HKF Bax 和Caspase-3 表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2、Col1A1、Col3A1、α-SMA、p-ERK1/2 及ERK1/2 的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞增殖率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高；與TGP 組比較，TGP+ISO 組HKF Bax 和Caspase-3 表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2、Col1A1、Col3A1、α-SMA、p-ERK1/2及ERK1/2 的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞增殖率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低（均P＜0.05）。提示激活ERK 信號通路能逆轉(zhuǎn)TGP 對HKF 增殖、凋亡和纖維化的影響，見圖4、表4、表5。

表4 ISO 和TGP 對HKF 增殖、凋亡相關(guān)蛋白和凋亡率的影響(,n=9)

表4 ISO 和TGP 對HKF 增殖、凋亡相關(guān)蛋白和凋亡率的影響(,n=9)

與對照組比較:1）P＜0.05；與TGP 組比較:2）P＜0.05；表5 同

表5 ISO 和TGP 對HKF 纖維化標(biāo)記表達(dá)和ERK 信號通路的影響(,n=9)

表5 ISO 和TGP 對HKF 纖維化標(biāo)記表達(dá)和ERK 信號通路的影響(,n=9)

圖4 Western 印跡檢測HKF 蛋白表達(dá)

3 討論

HKF 具有腫瘤樣細(xì)胞特性，其異常增殖活動和膠原蛋白的過度合成導(dǎo)致的持續(xù)性組織纖維化是皮膚瘢痕的常見表現(xiàn)。目前，雖然瘢痕疙瘩的治療方法多種多樣，但仍存在不良反應(yīng)高、復(fù)發(fā)頻繁的風(fēng)險〔8〕。因此，探索對HKF 過度增殖的干預(yù)藥物對研究和治療瘢痕疙瘩具有重大意義。

TGP 是從白芍根中提取的具有生物活性的化合物。主要由5 種單萜苷組成，包括芍藥苷、羥芍藥苷、甲基花青苷、白化素和苯甲酰芍藥苷。芍藥苷含量最高，占TGP 活性成分的90%。自1998 年TGP被國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎〔9〕，隨后又被廣泛用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡〔10〕和干燥綜合征〔11〕的治療。研究顯示〔12〕，TGP 通過上調(diào)Samd7 表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1 表達(dá)，能減輕皮膚的纖維化，可有效緩解硬皮病皮膚硬化程度；TGP 可顯著防止大鼠肝纖維化，具有潛在的肝保護(hù)作用；此外，TGP 通過延長G2 期，阻滯S 期進(jìn)而抑制滑膜成纖維細(xì)胞過度增殖對骨性關(guān)節(jié)炎具有治療作用〔13〕。以上研究發(fā)現(xiàn)是臨床應(yīng)用TGP 治療瘢痕疙瘩的基礎(chǔ)。

本研究與王歡等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)TGP 對滑膜成纖維細(xì)胞的雙重作用類似。瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制與成纖維細(xì)胞異?；顒雍徒M織纖維化有關(guān)〔14〕，抑制HKF的增殖和膠原的合成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡是抑制瘢痕形成的關(guān)鍵。MAPK/ERK 信號通路參與正常創(chuàng)面愈合和致病性纖維化，研究表明〔15～18〕，ERK 磷酸化在瘢痕疙瘩組織和成纖維細(xì)胞中顯著增加，干預(yù)ERK信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)可抑制HKF 增殖，并促進(jìn)凋亡，抑制膠原合成。因此，推測較高濃度TGP 通過抑制ERK信號通路活化進(jìn)而抑制HKF 增殖、纖維化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上，較高濃度的TGP 能抑制HKF 增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與抑制ERK 信號通路有關(guān)。因此，TGP 具有治療瘢痕疙瘩的潛在價值。