高慧禎 李鳳麗 李蕾 康志強(qiáng) （鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院內(nèi)分泌科,河南 鄭州 450007）

糖尿病腎病是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，臨床特征主要表現(xiàn)為持續(xù)性蛋白尿〔1〕。足細(xì)胞是維持腎小球?yàn)V過(guò)膜正常功能的主要成分，其損傷后可導(dǎo)致濾過(guò)膜電荷和孔徑屏障破壞，形成蛋白尿〔2〕。高糖（HG）是誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡、損傷足細(xì)胞的一個(gè)重要因素〔3〕，探討影響HG 誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制可為糖尿病腎病的治療提供一定的新思路。長(zhǎng)鏈非編碼（Lnc）RNA 是一類長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA、在糖尿病、自身免疫、腫瘤等疾病中發(fā)揮重要 調(diào)控作 用〔4～6〕。小核仁RNA 宿主基 因（SNHG）14 是近年來(lái)在腫瘤中研究較多的一種LncRNA，其參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為〔7～9〕。研究還顯示，SNHG14 與心腦血管疾病、炎癥等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔10〕。但目前，SNHG14 在糖尿病腎病中的作用還未知。本研究主要探討SNHG14 對(duì)HG 誘導(dǎo)的小鼠腎臟足細(xì)胞MPC5 損傷的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 小鼠腎臟足細(xì)胞系MPC5，賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；胎牛血清（FBS），浙江天杭生物科技有限公司；D-葡萄糖，美國(guó)Gibco公司；LipofectamineTM2000 試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司；Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒，日本Takara 公司；B 細(xì)胞淋巴瘤（Bcl）-2、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）和酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）-3 抗體，中國(guó)Abcam 公司；nephrin、podocin 和synaptopodin 抗體，美國(guó)Maine 公司；SNHG14 的小干擾RNNA（si-NHG14）及過(guò)表達(dá)載體（pcDNA-SNHG14）、小干擾RNNA 陰性序列（si-NC）、空載體（pcDNA）、miR-16-5p 模擬物（mimic）及抑制劑（anti-miR-16-5p）、模擬對(duì)照序列（miR-NC）及抑制劑對(duì)照序列（anti-miRNC），上海吉?jiǎng)P基因公司；PCR 引物序列，上海生工生物工程股份有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基、Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白測(cè)定試劑盒，北京索萊寶公司；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Promega 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇MPC5 細(xì)胞后，用含10% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基、置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90% 時(shí)，用0.25% 胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 qRT-PCR 檢測(cè)SNHG14 和miR-16-5p 表達(dá) 培養(yǎng)結(jié)束后，Trizol 試劑提取細(xì)胞中總RNA，微量核酸儀檢測(cè)RNA 的純度和濃度后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增程序:95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)。引物序列:SNHG14 上游5＇-GGGTGTTTACGTAGACCAGAACC-3＇，下游5＇-CTTCCAAAAGC CTTCTGCCTTAG-3＇；miR-16-5p 上游5＇-CTCGCTAGCAGCACGTAAATA-3＇，下 游 5＇-TCCAGTGCAGGG TCCGAGGT-3＇；GAPDH 上 游5＇-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3＇，下 游5＇-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3＇；U6 上游5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇，下游5＇-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇。SNHG14 以GAPDH 為內(nèi)參，miR-16-5p 以U6 為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算SNHG14 和miR-16-5p 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證SNHG14 與miR-16-5p 靶向關(guān)系 取2.5 ml 對(duì)數(shù)期MPC5 細(xì)胞（2.5×104個(gè)/ml）接種于6 孔板中，培養(yǎng)12 h 后，棄培養(yǎng)基，換為不含F(xiàn)BS 的RPMI1640 培養(yǎng)基。利用LipofectamineTM2000 試劑盒，分別將miR-16-5p 與WT-SNHG14、miR-NC 與WT-SNHG14、miR-16-5p 與MUT-SNHG14、miR-NC 與MUT-SNHG14 共轉(zhuǎn)染至MPC5 細(xì)胞。分為miR-16-5p+WT-SNHG14 組、miRNC+WT-SNHG14 組、miR-16-5p+MUT-SNHG14 組、miR-NC+MUT-SNHG14 組。轉(zhuǎn)染后12 h，更換為完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)基。加細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清液，利用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲(chóng)與海參的熒光強(qiáng)度的比值表示。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取2.5 ml 對(duì)數(shù)期MPC5 細(xì)胞（2.5×104個(gè)/ml）接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，棄培養(yǎng)基，換為不含F(xiàn)BS 的RPMI1640 培養(yǎng)基。利用LipofectamineTM2000 試劑盒，分別轉(zhuǎn)染si-SNHG14、si-NC、pcDNA-SNHG14、pcDNA、miR-16-5p mimics、miR-NC、si-SNHG14+anti-miR-16-5p、si-SNHG14+anti-NC 至MPC5 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后12 h，更換為完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h，qRT-PCR 檢測(cè)SNHG14 或miR-16-5p 水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，方法同1.2.2，并收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 細(xì)胞分組處理 取2.5 ml MPC5 細(xì)胞或轉(zhuǎn)染si-SNHG14、si-NC、miR-16-5p mimics、miR-NC、si-SNHG14+anti-miR-16-5p、si-SNHG14 +anti-miR-NC的細(xì)胞（2.5×104個(gè)/ml）均接種至6 孔板中，培養(yǎng)12 h 后，分組處理。將MPC5 細(xì)胞分為對(duì)照組（NC組）和HG 組，其中NC 組細(xì)胞使用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；HG 組細(xì)胞用含30 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基作用24 h。將 轉(zhuǎn)染si-SNHG14、si-NC、miR-16-5p mimics、miR-NC、si-SNHG14+anti-miR-16-5p、si-SNHG14+anti-miR-NC 的細(xì)胞均用含30 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基作用24 h，并分別記為HG+si-SNHG14 組、HG+si-NC 組、HG+miR-16-5p 組、HG+miR-NC 組、HG+si-SNHG14 +anti-miR-16-5p 組 和HG+si-SNHG14+anti-miR-NC 組。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，采用Western 印跡檢測(cè)細(xì)胞中nephrin、podocin、synaptopodin、Bax、Bcl-2 和cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染si-SNHG14、si-NC、pcDNA-SNHG14、pcDNA、miR-16-5p mimics、miR-NC 的MPC5 細(xì)胞分別記為si-SNHG14組、si-NC 組、pcDNA-SNHG14 組、pcDNA 組、miR-16-5p 組、miR-NC 組。

1.2.6 Western 印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 取各組處理后的細(xì)胞，加 RIPA 裂解液 裂解細(xì) 胞，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA 法檢測(cè)蛋白含量。然后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將分離蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，并置于5 %脫脂牛奶中封閉2 h。于4℃冰箱中分別用nephrin、podocin、synaptopodin、Bax、Bcl-2、酶切caspase-3 及GAPDH 一抗孵育過(guò)夜，洗膜后，用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h。加化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J 軟件分析目的蛋白相對(duì)GAPDH 的表達(dá)量。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取各組處理后的細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞2 次。參照Annexin V-FITC/PI 試劑盒操作說(shuō)明，取1.0×106個(gè)細(xì)胞，加500 μl 結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞。加10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。再加5 μl PI，室溫避光孵育5 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 HG 對(duì)小鼠腎臟足細(xì)胞MPC5 中SNHG14 和miR-16-5p 表達(dá)的影響 HG 組MPC5 細(xì)胞中SNHG14 水平顯著高于NG 組（P＜0.05），miR-16-5p水平顯著低于NG 組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 HG 對(duì)MPC5 細(xì)胞中SNHG14 和miR-16-5p表達(dá)的影響(,n=9)

表1 HG 對(duì)MPC5 細(xì)胞中SNHG14 和miR-16-5p表達(dá)的影響(,n=9)

2.2 SNHG14 靶向調(diào)控miR-16-5p 的表達(dá) 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，SNHG14 的序列中含有與miR-16-5p 互補(bǔ)的核苷酸序列，見(jiàn)圖1。miR-16-5p+WTSNHG14 組MPC5 細(xì)胞熒光素酶活性（0.41±0.04）顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-NC 與WT-SNHG14 組（0.98±0.08，t=19.118，P=0.000），而miR-16-5p+MUTSNHG14 組MPC5 細(xì)胞熒光素酶活性（1.02±0.08）與miR-NC+MUT-SNHG14 組（1.03±0.09）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.249，P=0.806）。pcDNA-SNHG14組MPC5 細(xì)胞中miR-16-5p 的表達(dá)量（0.38±0.04）顯著低于pcDNA 組（1.00 ±0.08，P＜0.05），si-SNHG14 組MPC5 細(xì)胞中miR-16-5p 的表達(dá)量高于si-NC 組（0.99±0.09，P＜0.05）。

圖1 SNHG14 的序列中含有與miR-16-5p 互補(bǔ)的核苷酸序列

2.3 抑制SNHG14 對(duì)HG 誘導(dǎo)的小鼠腎臟足細(xì)胞MPC5 中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白表達(dá)的影響 si-SNHG14 組MPC5 細(xì)胞中SNHG14 水平（0.23±0.02）顯著低于si-NC 組（1.02±0.09，t=25.706，P＜0.05），說(shuō)明si-SNHG14 轉(zhuǎn)染成功，MPC5細(xì)胞中SNHG14 的表達(dá)受到抑制。HG 組MPC5 細(xì)胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白的表達(dá)量顯著低于NG 組（P＜0.05）。HG+si-SNHG14 組MPC5 細(xì)胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白的表達(dá)量顯著高于HG+si-NC 組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 抑制SNHG14 對(duì)HG 誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白表達(dá)的影響

表2 抑制SNHG14 表達(dá)對(duì)HG 誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞中synaptopodin、nephrin 和podocin蛋白表達(dá)的影響(,n=9)

表2 抑制SNHG14 表達(dá)對(duì)HG 誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞中synaptopodin、nephrin 和podocin蛋白表達(dá)的影響(,n=9)

與NG 組比較:1）P＜0.05；與HG+si-NC 組比較:2）P＜0.05；下表同

2.4 抑制SNHG14 對(duì)HG 誘導(dǎo)的小鼠腎臟足細(xì)胞MPC5 凋亡的影響 HG 組MPC5 細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中Bax、酶切caspase-3 蛋白的表達(dá)量均顯著高于NG組（P＜0.05），而B(niǎo)cl-2 蛋白的表達(dá)量顯著低于NG 組（P＜0.05）。HG+si-SNHG14 組MPC5 細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中Bax、酶切caspase-3 蛋白的表達(dá)量均顯著低于HG+si-NC 組（P＜0.05），而B(niǎo)cl-2 蛋白的表達(dá)量顯著高于HG+si-NC 組（P＜0.05）。見(jiàn)圖3，圖4，表3。

表3 抑制SNHG14 高糖誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞凋亡的影響(,n=9)

表3 抑制SNHG14 高糖誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞凋亡的影響(,n=9)

圖3 抑制SNHG14 對(duì)HG 誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4 抑制SNHG14 HG 誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞凋亡率的影響

2.5 過(guò)表達(dá)miR-16-5p 對(duì)HG 誘導(dǎo)的小鼠腎臟足細(xì)胞MPC5 損傷的影響 miR-16-5p 組MPC5 細(xì)胞中miR-16-5p 水平（2.28±0.12）顯著高于miR-NC組（1.00±0.05，t=29.538，P＜0.05），說(shuō)明miR-16-5p mimics 轉(zhuǎn)染成功，MPC5 細(xì)胞中miR-16-5p 過(guò)表達(dá)。HG+miR-16-5p 組MPC5 細(xì)胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白的表達(dá)量均顯著高于HG+miR-NC 組（P＜0.05），MPC5 細(xì)胞凋亡率和Bax、酶切caspase-3 蛋白的表達(dá)量均顯著低于HG+miR-NC組（P＜0.05），Bcl-2 蛋白的表達(dá)量顯著高于于HG+miR-NC 組（P＜0.05）。見(jiàn)圖5、表4。

圖5 Western 印跡檢測(cè)MPC5 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白及synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白表達(dá)的影響

表4 過(guò)表達(dá)miR-16-5p 對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞損傷的影響(,n=9)

表4 過(guò)表達(dá)miR-16-5p 對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞損傷的影響(,n=9)

2.6 干擾miR-16-5p 逆轉(zhuǎn)抑制SNHG14 對(duì)HG誘導(dǎo)的小鼠腎臟足細(xì)胞MPC5 損傷的作用 HG+si-SNHG14+anti-miR-16-5p 組MPC5 細(xì) 胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白的表達(dá)量均顯著低于HG+si-SNHG14+anti-miR-NC 組（P＜0.05），MPC5 細(xì)胞凋亡率和Bax、cleaved-caspase-3 蛋白的表達(dá)量均顯著高于HG+si-SNHG14+anti-miR-NC 組（P＜0.05），Bcl-2 蛋白的表達(dá)量顯著低于HG+si-SNHG14+anti-miR-NC 組（P＜0.05）。見(jiàn)圖6、表5。

圖6 Western 印跡檢測(cè)MPC5 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白表達(dá)的作用

表5 干擾miR-16-5p 逆轉(zhuǎn)抑制SNHG14 對(duì)HG 誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞損傷的作用(,n=9)

表5 干擾miR-16-5p 逆轉(zhuǎn)抑制SNHG14 對(duì)HG 誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞損傷的作用(,n=9)

3 討論

糖尿病腎病是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因之一，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，研究認(rèn)為足細(xì)胞損傷在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔11〕。HG 是造成足細(xì)胞損傷的重要原因之一，可直接損傷足細(xì)胞，并誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。足細(xì)胞裂隙膜蛋白nephrin、podocin 和骨架蛋白synaptopodin 參與足細(xì)胞損傷〔12〕。本研究結(jié)果表明HG 環(huán)境下，基底膜蛋白受損，足細(xì)胞屏障破壞障礙。Bax/Bcl-2 參與調(diào)控細(xì)胞凋亡，Bax 表達(dá)升高可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2 作用與Bax 相反，表達(dá)升高抑制細(xì)胞凋亡。Caspases 介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，caspase-3 是caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)核心分子，被活化后執(zhí)行細(xì)胞凋亡〔13，14〕。本研究結(jié)果說(shuō)明HG 誘導(dǎo)促進(jìn)了MPC5 細(xì)胞凋亡，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)，SNHG14 參與腦卒中、腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展〔15〕。Cao 等〔16〕研究顯示，抑制SNHG14表達(dá)可抑制脂多糖誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元凋亡和caspase-3 活性升高。本研究結(jié)果提示SNHG14 參與足細(xì)胞損傷過(guò)程；與SNHG14 表達(dá)未被抑制的MPC5 細(xì)胞相比，SNHG14 表達(dá)抑制的MPC5 細(xì)胞被HG 誘導(dǎo)后，細(xì)胞中nephrin、podocin 和synaptopodin蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明抑制SNHG14 表達(dá)可降低足細(xì)胞損傷，改善足細(xì)胞屏障破壞障礙；抑制SNHG14 表達(dá)可降低HG 誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞凋亡。

研究顯示，miR-16-5p 與糖尿病、胰島素抵抗等密切相關(guān)，在糖尿病的發(fā)展過(guò)程中起重要作用〔17，18〕。張琳等〔19〕研究顯示，糖尿病腎病患者血清中miR-16-5p 表達(dá)水平降低，且與患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。但目前，miR-16-5p 對(duì)腎臟足細(xì)胞損傷及凋亡的影響還未知。本研究結(jié)果說(shuō)明miR-16-5p 對(duì)HG 誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用；抑制SNHG14 表達(dá)通過(guò)上調(diào)miR-16-5p 表達(dá)進(jìn)而保護(hù)HG 誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞損傷及抑制其凋亡。