彭勝利 肖婷 彭開(kāi)利 謝碧容 （ 武漢市金銀潭醫(yī)院內(nèi)科,湖北 武漢 43003; 武漢市蔡甸中醫(yī)院）

肺癌主要包括非小細(xì)胞肺癌與小細(xì)胞肺癌兩種病理類型，其中非小細(xì)胞肺癌占據(jù)較大比例，其具有較高的發(fā)病率與死亡率，目前臨床治療肺癌已取得一定進(jìn)展但患者預(yù)后較差〔1〕。肺癌早期無(wú)明顯臨床特征，患者確診時(shí)已處于肺癌晚期，而腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲是導(dǎo)致肺癌患者高死亡率的主要原因〔2〕。由于肺癌發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明導(dǎo)致臨床缺乏行之有效的治療手段，因而尋找與肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)的基因或蛋白均可為肺癌治療提供新靶點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）異常表達(dá)可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)過(guò)程，研究顯示在非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)LncRNA 表達(dá)升高或降低均可影響腫瘤發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程〔3〕。LncRNA 鋅指結(jié)構(gòu)反義轉(zhuǎn)錄本（LncRNA ZFAS）1 在非小細(xì)胞肺癌患者中高表達(dá)并與患者不良預(yù)后相關(guān)，但關(guān)于其在非小細(xì)胞癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的可能作用機(jī)制尚未完全闡明〔4〕。研究表明ZFAS1 還可促進(jìn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、宮頸癌等多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展〔5〕。利用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)ZFAS1 可能作用于微小RNA-432-5p（miR-432-5p），研究顯示miR-432-5p 在乳腺癌、肺癌及肝癌等多種惡性腫瘤中均呈低表達(dá)并可發(fā)揮抑癌作用〔6，7〕。然而，ZFAS1 是否通過(guò)靶向調(diào)控miR-432-5p 的表達(dá)影響肺癌發(fā)生及發(fā)展尚未研究，本研究主要探討ZFAS1 對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，并初步分析其是否通過(guò)調(diào)控miR-432-5p 而發(fā)揮作用，可為肺癌靶向治療提供潛在作用靶點(diǎn)，有助于提高肺癌患者生存率并改善患者預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肺癌細(xì)胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446 均購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所；人正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B 購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司。miR-432-5p mimic、miR-432-5p 抑制劑（anti-miR-432-5p）、ZFAS1 siRNA（si-ZFAS1）及其各自陰性對(duì)照質(zhì)粒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher 公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR PCR Master Mix 試劑盒均購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；MTT 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自百奧萊博科技有限公司；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgGⅡ抗體、兔抗人細(xì)胞周期素（CyclinD1）單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔抗人CyclinE 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；Transwell 小室、聚偏氟乙烯（PVDF）膜均購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Coring 公司；電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒購(gòu)自英國(guó)Amersham公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 肺癌細(xì)胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446 與正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B 均常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及雙抗的DMEM 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為溫度37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、相對(duì)濕度95%，每隔1 d 更換1 次培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d 后進(jìn)行傳代，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)研究。ZFAS1 轉(zhuǎn)染處理及分組:采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)在A549 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染ZFAS1 siRNA及其陰性對(duì)照質(zhì)粒（si-con）分別為si-ZFAS1 組、sicon 組；進(jìn)一步驗(yàn)證ZFAS1 靶向調(diào)控miR-432-5p 的表達(dá)，在A549 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA-ZFAS1、si-ZFAS1 及其各自陰性對(duì)照，分別為pcDNA-ZFAS1組、si-ZFAS1 組、pcDNA 組、si-con 組。miR-432-5p轉(zhuǎn)染處理及分組:在A549 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-432-5p mimic、miR-con，分別為miR-432-5p 組、miRcon 組。為驗(yàn)證ZFAS1 是否通過(guò)靶向調(diào)節(jié)miR-432-5p 表達(dá)而發(fā)揮作用，分別將si-ZFAS1 與anti-miRcon、anti-miR-432-5p 共同轉(zhuǎn)染入A549 細(xì)胞，分別為si-ZFAS1+anti-miR-con 組、si-ZFAS1+anti-miR-432-5p 組。轉(zhuǎn)染條件為:轉(zhuǎn)染前1 d 更換為不含胎牛血清及雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后6 h 更換為含胎牛血清及雙抗的新鮮DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞中LncRNA ZFAS1、miR-432-5p 表達(dá)水平用Trizol 試劑提取H1299、A549、SPC-A-1、NCH446、BEAS-2B 細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后各組A549 細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 并將其用于qRT-PCR，配制反應(yīng)體系為20 μl，包括2 μl cDNA，LncRNA ZFAS1、miR-432-5p 正反向引物各0.8 μl，10 μl/孔SYBR Premix Ex Taq（2×），ddH2O 6 μl/孔，ROX 0.4 μl/孔。配制體系后將其置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃2 min 循環(huán)1 次，95℃15 s，60℃60 s，72℃30 s 循環(huán)40 次。ZFAS1 以GAPDH 為內(nèi)參基因，miR-432-5p 以U6 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算ZFAS1、miR-432-5p 相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Western 印跡檢測(cè)CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，加入100 μl 蛋白裂解液，細(xì)胞裂解物經(jīng)4℃條件下12 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清并用二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定蛋白濃度，加入十二烷基硫酸鈉（SDS）-上樣緩沖液在100℃恒溫水浴鍋內(nèi)孵育5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，脫脂牛奶封閉2 h 后，分別加入CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白一抗（1 ∶500），TBST 洗滌，4℃條件下加入二抗（1 ∶5 000）孵育2 h，TBST 洗膜，用ECL 試劑盒進(jìn)行顯影反應(yīng)，應(yīng)用凝膠分析系統(tǒng)及Image J 圖像分析軟件對(duì)各條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 應(yīng)用生物信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)ZFAS1 與miR-432-5p 的結(jié)合片段，利用PCR擴(kuò)增ZFAS1 基因序列上二者結(jié)合片段，將結(jié)合片段插入pMIR-REPORT 載體中構(gòu)建野生型WT-ZFAS1質(zhì)粒，利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變構(gòu)建MUT-ZFAS1 突變質(zhì)粒，分別用WT-ZFAS1 質(zhì)粒、MUT-ZFAS1 突變質(zhì)粒與miR-432-5p mimic 分別或同時(shí)對(duì)A549 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒對(duì)各組細(xì)胞熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)，各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.2.5 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)細(xì)胞/ml，以200 μl/孔接種于96 孔板，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h 以20 μl/孔加入MTT 溶液（濃度為5 mg/ml），置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、相對(duì)濕度95% 的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄MTT 液，以150 μl/孔分別加入二甲基亞砜（DMSO），振蕩混勻，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度（OD490）值。

1.2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 用不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液收集“1.2.1”中各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549 細(xì)胞，接種于Transwell 小室的上室（細(xì)胞密度為1×105個(gè)細(xì)胞/孔），Transwell 小室的下室加入含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（500 μl），繼續(xù)培養(yǎng)12 h，取出Transwell 小室并用棉簽刮取Transwell 小室上層細(xì)胞，甲醇（100%）固定30 min，用PBS 洗滌后結(jié)晶紫染色15 min，將其放入顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野觀察遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 次重復(fù)。

1.2.7 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 按照細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)收取細(xì)胞并進(jìn)行相同處理，預(yù)先用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠，稀釋至濃度為1 mg/μl，分別取60 μl 稀釋后的基質(zhì)膠置于Transwell 小室底部的上室面，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min，同時(shí)將收取的細(xì)胞接種于Transwell 小室上室（1×104個(gè)細(xì)胞/孔），吸取含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基500 μl置于Transwell 小室的下室，刮出Transwell 小室上層細(xì)胞用100%甲醇固定，30 min 后用PBS 洗滌，結(jié)晶紫染色15 min，置于顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取5 個(gè)視野計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 次重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0 進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 肺癌細(xì)胞株中ZFAS1 和miR-432-5p 的表達(dá) qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示（表1），與人正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B 相比，人肺癌細(xì)胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446 中ZFAS1 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），而miR-432-5p 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），不同肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 細(xì)胞中ZFAS1 表達(dá)水平相對(duì)較高，而miR-432-5p 表達(dá)水平相對(duì)較低，因此選取A549 細(xì)胞為后續(xù)研究細(xì)胞。

表1 肺癌細(xì)胞株中ZFAS1 和miR-432-5p 的表達(dá)(,n=3)

表1 肺癌細(xì)胞株中ZFAS1 和miR-432-5p 的表達(dá)(,n=3)

與BEAS-2B 比較:1）P＜0.05

2.2 干擾ZFAS1 表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549 增殖的影響 與si-con組比較，si-ZFAS1組ZFAS1表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），表明轉(zhuǎn)染成功。與si-con 組比較，si-ZFAS1 組48、72 h 細(xì)胞OD 值明顯降低（P＜0.05），同時(shí)Western 印跡檢測(cè)結(jié)果顯示si-ZFAS1 組細(xì)胞CyclinE、CyclinD1 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)表2、圖1。表明干擾ZFAS1 表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞A549 增殖。

表2 下調(diào)ZFAS1 表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549 增殖的影響(,n=3)

表2 下調(diào)ZFAS1 表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549 增殖的影響(,n=3)

圖1 檢測(cè)肺癌細(xì)胞A549 增殖蛋白CyclinE 和CyclinD1 的表達(dá)

2.3 干擾ZFAS1 表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549 遷移和侵襲的影響 si-ZFAS1 組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)與si-con組比較明顯較少（P＜0.05）。與si-con 組比較，si-ZFAS1 組A549 細(xì)胞MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3、圖2、圖3。表明干擾ZFAS1 表達(dá)可通過(guò)降低MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制A549 細(xì)胞遷移及侵襲。

表3 下調(diào)ZFAS1 表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549 增殖、遷移、侵襲及MMP-2、-9 蛋白表達(dá)的影響(,n=3)

表3 下調(diào)ZFAS1 表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549 增殖、遷移、侵襲及MMP-2、-9 蛋白表達(dá)的影響(,n=3)

圖2 檢測(cè)肺癌細(xì)胞A549 遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

圖3 Western 印跡肺癌細(xì)胞A549 轉(zhuǎn)移蛋白的表達(dá)

2.4 ZFAS1 靶向調(diào)控miR-432-5p 的表達(dá) 用生物信息預(yù)測(cè)檢測(cè)出ZFAS1 上存在miR-432-5p 結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果（圖4、表4）顯示，miR-432-5p mimic 可顯著降低野生型WT-ZFAS1質(zhì)粒的熒光素酶活性（P＜0.05），但對(duì)突變型MUTZFAS1 質(zhì)粒熒光素酶活性無(wú)明顯影響（P＞0.05）。表明ZFAS1 與miR-432-5p 之間存在靶向調(diào)控關(guān)系。qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-con 組、si-ZFAS1 組、pcDNA 組、pcDNA-ZFAS1 組，miR-432-5p 表達(dá)分別為:1.00±0.05、7.26±0.46、1.65±0.14、0.48±0.07，si-ZFAS1 組miR-432-5p 表達(dá)顯著高于si-con 組（P＜0.05），pcDNA-ZFAS1 組miR-432-5p 表達(dá)水平明顯低于pcDNA 組（P＜0.05）。表明ZFAS1 可負(fù)向調(diào)控miR-432-5p 表達(dá)。

圖4 ZFAS1 與miR-432-5p 互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(,n=3)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(,n=3)

2.5 過(guò)表達(dá)miR-432-5p 對(duì)肺癌細(xì)胞A549 增殖、遷移、侵襲的影響 miR-432-5p 組A549 細(xì)胞miR-432-5p 表達(dá)水平顯著高于miR-con 組（P＜0.05），提示基因轉(zhuǎn)染技術(shù)能夠提高miR-432-5p 在肺癌細(xì)胞A549 細(xì)胞中的表達(dá)水平，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。與miR-con 組比較，miR-432-5p 組48 h、72 h A549 細(xì)胞OD 值、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低（P＜0.05），Western 印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖5、表5。表明上調(diào)miR-432-5p 表達(dá)能夠通過(guò)下調(diào)CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞A549 增殖、遷移、侵襲。

圖5 Western 印跡肺癌細(xì)胞A549 增殖和轉(zhuǎn)移蛋白的表達(dá)

表5 上調(diào)miR-432-5p 表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549 增殖、遷移、侵襲及CyclinE、D1 和MMP-2、-9 表達(dá)的影響(,n=3)

表5 上調(diào)miR-432-5p 表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549 增殖、遷移、侵襲及CyclinE、D1 和MMP-2、-9 表達(dá)的影響(,n=3)

2.6 沉默ZFAS1 表達(dá)和干擾miR-432-5p 表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549 增殖、遷移、侵襲的作用 MTT、Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-ZFAS1+anti-miR-432-5p 組A549 細(xì)胞48 h、72 h OD 值、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均比si-ZFAS1+anti-miR-con 組明顯升高（P＜0.05），Western 印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-ZFAS1+anti-miRcon 組相比，si-ZFAS1+anti-miR-432-5p 組A549 細(xì)胞CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖6、表6。表明干擾miR-432-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)沉默ZFAS1 表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549 增殖、遷移及侵襲的抑制作用。

表6 干擾miR-432-5p 表達(dá)逆轉(zhuǎn)沉默ZFAS1 表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549 增殖、遷移、侵襲的抑制作用及Cyclin E、D1 和MMP-2、-9 表達(dá)(,n=3)

表6 干擾miR-432-5p 表達(dá)逆轉(zhuǎn)沉默ZFAS1 表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549 增殖、遷移、侵襲的抑制作用及Cyclin E、D1 和MMP-2、-9 表達(dá)(,n=3)

與si-con 組比較:1）P＜0.05；與si-ZFAS1+anti-miR-con 組比較:2）P＜0.05

圖6 Western 印跡肺癌細(xì)胞A549 增殖和轉(zhuǎn)移蛋白的表達(dá)

3 討論

肺癌靶向治療研究取得一定效果但患者死亡率仍逐年升高，同時(shí)患者治療后死亡率仍未得到有效改善〔8〕。因此尋找肺癌早期診斷靶點(diǎn)及評(píng)估患者預(yù)后的有效分子標(biāo)志物對(duì)降低患者死亡率具有重要意義。近年來(lái)LncRNA 在肺癌等多種惡性腫瘤中的表達(dá)及作用引起重視，其主要可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性吸附miRNA 而降低其表達(dá)水平進(jìn)而參與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程〔9，10〕。

ZFAS1 是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，研究顯示ZFAS1 在肝細(xì)胞癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞增殖及遷移過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用〔11，12〕。鄭茁等〔13〕研究表明ZFAS1 在鼻咽癌組織中呈高表達(dá)并與患者臨床分期等臨床病理特征密切相關(guān)，同時(shí)可作為早期診斷及評(píng)估患者疾病進(jìn)展的重要分子標(biāo)志物。李彥儒等〔14〕研究表明ZFAS1 表達(dá)異常還與心力衰竭及心肌梗死等多種心血管疾病有關(guān)，同時(shí)乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤組織及細(xì)胞中ZFAS1 表達(dá)均明顯升高并可促進(jìn)癌癥發(fā)生及發(fā)展。相關(guān)研究表明ZFAS1在非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中表達(dá)水平升高，沉默ZFAS1 表達(dá)可誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期阻滯并通過(guò)抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲〔15〕。本研究結(jié)果顯示ZFAS1 在肺癌細(xì)胞中均呈高表達(dá)，提示ZFAS1 可能在肺癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促癌作用。通過(guò)siRNA 將肺癌A549 細(xì)胞中的ZFAS1 進(jìn)行下調(diào)，腫瘤細(xì)胞增殖活性明顯降低，同時(shí)CyclinE、CyclinD1 蛋白表達(dá)均顯著降低，而細(xì)胞周期紊亂是導(dǎo)致肺癌發(fā)生及發(fā)展的重要原因，CyclinE、CyclinD1 是細(xì)胞周期蛋白激酶復(fù)合物并可調(diào)控細(xì)胞周期〔16〕，說(shuō)明沉默ZFAS1 可通過(guò)抑制CyclinE、CyclinD1 蛋白表達(dá)影響細(xì)胞周期進(jìn)而抑制肺癌A549 細(xì)胞增殖。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)沉默ZFAS1 表達(dá)后A549 細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少，而MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)均明顯降低，MMP-2、MMP-9 是MMPs 家族成員，其可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移及浸潤(rùn)〔17〕。說(shuō)明沉默ZFAS1可通過(guò)抑制MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞遷移及侵襲。提示ZFAS1 可能通過(guò)上調(diào)CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

miR-432 在骨肉瘤細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)miR-432表達(dá)能夠靶向調(diào)控CX3C 趨化因子配體（CX3CL）1進(jìn)而抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲〔18〕。乳腺癌患者外泌體miR-432-5p 表達(dá)水平升高可增強(qiáng)患者對(duì)化療藥物的敏感性〔19〕。Rihani 等〔20〕研究表明miR-432-5p 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中呈低表達(dá)并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未可知。Li 等〔21〕研究表明LncRNA625 通過(guò)靶向miR-432 調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡。Chen 等〔22〕研究表明miR-432 通過(guò)靶向E2F 轉(zhuǎn)錄因子（E2F）3 和受體酪氨酸激酶（AXL）而抑制肺腺癌細(xì)胞增殖。然而，關(guān)于miR-432-5p 在肺癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的具體作用尚未完全闡明。本研究結(jié)果顯示miR-432-5p 在肺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-432-5p 表達(dá)可有效抑制肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，同時(shí)本研究從生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)到miR-432-5p 與ZFAS1 有相似的結(jié)合序列位點(diǎn)，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-432-5p 可影響ZFAS1 的熒光素酶活性，說(shuō)明miR-432-5p 與ZFAS1 存在相互調(diào)控關(guān)系。沉默ZFAS1 的表達(dá)后miR-432-5p 的表達(dá)上調(diào)，ZFAS1 過(guò)表達(dá)后miR-432-5p 的表達(dá)下調(diào)，提示ZFAS1 可抑制miR-432-5p 的表達(dá)水平。通過(guò)anti-miR-432-5p 轉(zhuǎn)染si-ZFAS1 的A549 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)si-ZFAS1+antimiR-432-5p 組A549 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力均得到明顯提高，同時(shí)CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，說(shuō)明ZFAS1 可靶向抑制miR-432-5p 的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)A549 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，抑制miR-432-5p 表達(dá)可在一定程度上增強(qiáng)ZFAS1 對(duì)A549 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的促進(jìn)作用。提示沉默ZFAS1 表達(dá)可通過(guò)上調(diào)miR-432-5p 表達(dá)進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，有望成為肺癌靶向治療的新型靶點(diǎn)。

綜上所述，ZFAS1 可調(diào)控miR-432-5p 表達(dá)而影響肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，為揭示肺癌發(fā)生的分子機(jī)制及探索新型靶標(biāo)基因提供依據(jù)。但本研究存在一定局限性，關(guān)于ZFAS1 在肺癌組織中的表達(dá)變化及其與患者預(yù)后的關(guān)系均需進(jìn)一步研究，同時(shí)ZFAS1 與肺癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程相關(guān)信號(hào)通路的作用關(guān)系仍需深入探索。