劉文選 （淄博市第一醫(yī)院皮膚科,山東 淄博 255200）

隨著人們生存環(huán)境變化、臭氧層破壞、室外活動增加等，皮膚鱗癌發(fā)病率有逐年增加趨勢，嚴(yán)重威脅人們生命健康和生活質(zhì)量〔1，2〕。皮膚鱗癌一般惡性程度較低，預(yù)后較好，但若病情未得到控制而發(fā)生轉(zhuǎn)移則預(yù)后較差〔3，4〕。因此尋找控制皮膚鱗癌細胞有效治療方法有重要意義。白花蛇舌草是茜草科耳草屬植物白花蛇舌草的干燥全草，是一種傳統(tǒng)的中草藥，有抗癌、抗氧化、抗炎和保護神經(jīng)等作用〔5〕。白花蛇舌草多糖（HDP）是白花蛇舌草的主要成分和重要的生物活性物質(zhì)，有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，已被報道在體內(nèi)外均能抑制肺癌、肝癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移〔6～8〕。但目前HDP 對皮膚鱗癌細胞生物學(xué)行為的影響及其機制尚不清楚。本研究旨在探討HDP 對皮膚鱗癌細胞A431 增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑 皮膚鱗癌A431 細胞（杭州仟諾生物科技有限公司）；HDP 溶液配制〔HDP 粉末（純度90%）購自湖北省中藥材公司，經(jīng)HDP 粉末融于超純水中，經(jīng)0.48 μm 微孔過濾，滅菌15 min，制成濃度為800 μg/ml 的母液，冷卻后封口，置于4℃冰箱中保存〕；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司）；miR-21-5p 抑制物（miR-21-5p inhibitor，anti-miR-21-5p）及其陰性對照（miRNA inhibitor，anti-miR-NC）、miR-21-5p 模擬物（miR-21-5p mimics，miR-21-5p）及其陰性對照（miRNA mimics，miR-NC）、小干擾RNA無意義序列（siRNA-NC，si-NC）及siRNA-PAG1（si-PAG1）由廣州銳博生物科技有限公司合成提供；四甲基偶氮唑藍（MTT）溶液（5 mg/ml，Solarbio 公司）；Annexin V/PI 細胞凋亡試劑盒（Best Bio 貝博生物）；Trizol 試劑（Invitrogen 公司）；RIPA 裂解液（碧云天生物科技研究所）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 皮膚鱗癌A431 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫飽濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期，棄培養(yǎng)基并加入0.25%胰酶消化細胞，進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期A431 細胞，用含血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細胞密度為1×105個/ml，以每孔200 μl 接種于6 孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合60%左右，使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑，分別將anti-miR-NC、anti-miR-21-5p、miR-NC、miR-21-5p、si-NC、si-PAG1 分別轉(zhuǎn)染至A431 細胞。

1.2.2 細胞分組 根據(jù)HDP 處理濃度不同，細胞分組:對照組 為Con 組，細胞不 做處理；HDP 100 μg/ml 組:細胞培 養(yǎng)液中 加入終 濃度為100 μg/ml的HDP 處理；HDP 200 μg/ml 組:細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為200 μg/ml 的HDP 處理；HDP 400 μg/ml 組:細胞培 養(yǎng)液中 加入終 濃度為400 μg/ml的HDP 處理；HDP 800 μg/ml 組:細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為800 μg/ml的HDP 處理。根據(jù)轉(zhuǎn)染不同，細胞分組:anti-miR-NC 組:細胞轉(zhuǎn)染antimiR-NC；anti-miR-21-5p 組:細胞轉(zhuǎn)染anti-miR-21-5p；miR-NC 組:細胞轉(zhuǎn)染miR-NC；miR-21-5p 組:細胞轉(zhuǎn)染miR-21-5p；轉(zhuǎn)染方法見1.2.1。HDP+miRNC 組:細胞轉(zhuǎn)染miR-NC 后，給予HDP 200 μg/ml；HDP+miR-21-5p 組:細胞轉(zhuǎn)染miR-21-5p 后，給予HDP 200 μg/ml；HDP+si-NC 組:細胞轉(zhuǎn)染si-NC 后，給予HDP 200 μg/ml；HDP+si-PAG1 組:細胞轉(zhuǎn)染si-PAG1 后，給予HDP 200 μg/ml。

1.2.3 MTT 比色法 調(diào)整A431 細胞懸液密度為2×104個/ml，以每孔150 μl 接種于96 孔板，置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，分別加入HDP終濃度〔9〕100、200、400、800 μg/ml處理，每個濃度設(shè)置5 個重復(fù)孔，分別于繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 時，每孔加入20 μl MTT 溶液孵育4 h，吸除孔內(nèi)液體，加入150 μl 二甲基亞砜溶液震蕩孵育30 min。使用酶標(biāo)儀檢測每孔490 nm波長處吸光度值。

1.2.4 流式細胞儀實驗 將A431 細胞以2×105個/ml接種于細胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)48 h 后分別加入HDP 終濃度100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml、800 μg/ml處理，每個濃度設(shè)置5 個重復(fù)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后收集細胞，調(diào)整細胞懸液密度為1×106個/ml，以每管1 ml 加入流式管中，1 000 r/min離心3 min，棄上清。參照Annexin V/PI 細胞凋亡試劑盒說明書，加入1 ml 1×結(jié)合緩沖液重懸細胞，然后分別加入5 μl Annexin V 和10 μl PI 染色液避光孵育，流式細胞儀中檢測A431 細胞凋亡率。

1.2.5 Transwell 實驗 收集經(jīng)HDP 處理72 h 的A431 細胞，制成濃度為2×105個/ml 的單細胞懸液。取Transwell 小室，分別在小室的上室和下室加入150 μl 細胞懸液和600 μl DMEM 完全培養(yǎng)基，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，室溫下吸去上室液體并加入甲醇固定，然后加入Giemsa 染色液染色，使用清水輕輕沖洗下室后用無菌棉簽擦去上室表面細胞，200×顯微鏡下隨機選取5 個視野區(qū)計數(shù)細胞遷移數(shù)目；另取Transwell 小室，分別在小室的上室和下室加入50 μl 基質(zhì)膠和100 μl 基質(zhì)膠和無血清DMEM 培養(yǎng)基1 ∶5混合液，并在上室中接種50 μl細胞懸液，培養(yǎng)24 h 后，吸除上室液體4℃下加入5%戊二醛固定，然后加入0.1%結(jié)晶紫染色，200×顯微鏡下隨機選取5 個視野區(qū)計數(shù)細胞侵襲數(shù)目。

1.2.6 qRT-PCR 實驗 收集上述生長狀態(tài)良好的各組細胞，采用Trizol 法抽提總RNA，檢測RNA 樣品質(zhì)量、濃度和完整性符合實驗要求。進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA 后，以U6 為內(nèi)參基因采用染料法進行qPCR 反應(yīng)，檢測細胞中miR-21-5p 相對表達量。數(shù)據(jù)處理方法采用2-△△Ct法。

1.2.7 Western 印跡 收集上述生長狀態(tài)良好的各組細胞，加入RIPA 裂解液裂解提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白樣品濃度，向蛋白樣品中加入5 倍體積的1×十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液混勻，放入沸水中充分變性。取30～50 μg 變性后的蛋白樣品進行10%SDS-聚酰丙乙烯凝膠電泳（PAGE）。轉(zhuǎn)膜，使用5%脫脂奶粉封膜1 h 后，加入稀釋后的蛋白一抗4℃孵育過夜，然后加入稀釋后的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。顯影、曝光，根據(jù)蛋白條帶灰度值計算目的蛋白相對表達量。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?為證實miR-21-5p 靶向PAG1，本研究將PAG1 的3＇UTR 和突變的3＇UTR 分別構(gòu)建雙熒光素酶報告基因載體，分別與miR-21-5p、miR-NC 共轉(zhuǎn)染A431 細胞，轉(zhuǎn)染48 h后收獲細胞并檢測細胞中熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0 軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 HDP 對皮膚鱗癌細胞A431 增殖、凋亡的影響 與Con 組比較，HDP 不同濃度組皮膚鱗癌細胞A431 中CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達顯著降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05），p21、Bax 蛋白表達顯著升高，且呈濃度依賴性（P＜0.05），細胞增殖抑制率及凋亡率均顯著增加，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。選擇HDP 作用時間72 h，抑制率約為50% 的濃度（200 μg/ml）進行后續(xù)實驗。見圖1、表1。

表1 HDP 對A431 細胞增殖、凋亡的影響(,n=15)

表1 HDP 對A431 細胞增殖、凋亡的影響(,n=15)

與Con 組比較:1）P＜0.05；與HDP 100 μg/ml 組比較:2）P＜0.05；與HDP 200 μg/ml 組比較:3）P＜0.05；與HDP 400 μg/ml 組比較:4）P＜0.05

圖1 流式細胞儀檢測HDP 對A431 細胞凋亡的影響

2.2 HDP 對A431 細胞遷移、侵襲及miR-21-5p 表達的影響 與Con 組比較，HDP 200 μg/ml 組A431細胞中miR-21-5p 相對表達量顯著降低（P＜0.05），細胞中E-cadherin 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），MMP-2蛋白表達顯著降低（P＜0.05），細胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目顯著減少（P＜0.05）。見圖2、圖3、表2。

圖2 Transwell 實驗檢測HDP 對A431 細胞遷移、侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

圖3 Western 印跡檢測HDP 對A431 遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達

表2 HDP 對A431 細胞遷移、侵襲及miR-21-5p 表達的影響(,n=15)

表2 HDP 對A431 細胞遷移、侵襲及miR-21-5p 表達的影響(,n=15)

2.3 抑制miR-21-5p 表達對A431 細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 與anti-miR-NC 組比較，antimiR-21-5p 組A431 細胞中miR-21-5p 相對表達量顯著降低（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），p21、Bax 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），細胞增殖抑制率和細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05），細胞中E-cadherin 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），MMP-2 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），細胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目顯著減少（P＜0.05）。說明抑制miR-21-5p 能抑制A431 細胞增殖、遷移和侵襲并誘導(dǎo)A431 細胞凋亡。見表3，圖4。

圖4 Western 印跡檢測A431 細胞中增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白表達

表3 抑制miR-21-5p 表達對A431 細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響(,n=15)

表3 抑制miR-21-5p 表達對A431 細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響(,n=15)

2.4 過表達miR-21-5p 能逆轉(zhuǎn)HDP 對A431 細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 與HDP+miR-NC 組比較，HDP+miR-21-5p 組A431 細胞中miR-21-5p 相對表達量顯著升高（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），p21、Bax 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），細胞增殖抑制率和細胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05），細胞中E-cadherin 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），MMP-2 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），細胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目顯著增多（P＜0.05）。說明過表達miR-21-5p 后HDP 對A431 細胞的影響作用減弱。見圖5，表4。

圖5 Western 印跡檢測A431 細胞中增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白表達

表4 過表達miR-21-5p 能逆轉(zhuǎn)HDP 對A431 細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的作用(,n=15)

表4 過表達miR-21-5p 能逆轉(zhuǎn)HDP 對A431 細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的作用(,n=15)

2.5 miR-21-5p 靶向調(diào)控PAG1 生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-21-5p 能夠與PAG1 的3＇UTR 互補結(jié)合，見圖6；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，過表達miR-21-5p 明顯抑制A431 細胞中PAG1 轉(zhuǎn)錄活性，而將PAG1 的3＇UTR 突變后抑制作用消失。見表5。Western 印跡表明，過表達miR-21-5p 的A431 細胞中PAG1 蛋白表達明顯降低（P＜0.05），而抑制表達miR-21-5p 的A431 細胞中PAG1 蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。見圖7、表6。

表6 miR-21-5p 調(diào)控PAG1 mRNA 和蛋白表達(,n=15)

表6 miR-21-5p 調(diào)控PAG1 mRNA 和蛋白表達(,n=15)

與miR-NC 組比較:1）P＜0.05；與anti-miR-NC 組比較:2）P＜0.05

圖6 miR-21-5p 和PAG1 的互補序列

表5 雙熒光素酶報告實驗(,n=15)

表5 雙熒光素酶報告實驗(,n=15)

圖7 miR-21-5p 調(diào)控PAG1 的表達

2.6 抑制PAG1 能逆轉(zhuǎn)HDP 對A431 細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用 與HDP+si-NC 組比較，HDP+si-PAG1組A431 細胞中PAG1 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），p21、Bax 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），細胞增殖抑制率和細胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05），細胞中E-cadherin 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），MMP-2 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），細胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目顯著增多（P＜0.05）。見圖8、表7。說明抑制PAG1 后HDP 對A431 細胞的影響作用減弱。

圖8 Western 印跡檢測A431 細胞中增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白表達

表7 抑制PAG1 能逆轉(zhuǎn)HDP 對A431 細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的作用(,n=15)

表7 抑制PAG1 能逆轉(zhuǎn)HDP 對A431 細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的作用(,n=15)

3 討論

中藥輔助抗腫瘤治療是提高或改善腫瘤放化療治療的有效手段。中藥白花蛇舌草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其成藥味苦、淡，性寒，臨床實踐表明白花蛇舌草若配伍得當(dāng)可用于治療各類炎癥、腫瘤、泌尿系統(tǒng)感染等多種疾病〔10～12〕。研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草主要含有黃酮類、萜類、甾醇類、多糖類、有機酸類、生物堿、蒽醌類等活性成分，其中抗腫瘤活性的成分包括總多糖、總黃酮、甾醇類、三萜類等〔13〕。HDP 的抗腫瘤作用已有報道，如Lin 等〔6〕報道HDP 通過EGFR/Akt/ERK 信號通路抑制細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，從而阻斷肺腺癌細胞的轉(zhuǎn)移能力；景艷等〔14〕報道HDP 可通過調(diào)控細胞凋亡途徑誘導(dǎo)鼻咽癌細胞凋亡；張韜等〔15〕報道HDP 能夠有效抑制骨肉瘤細胞的增殖，阻滯細胞周期和促進細胞凋亡。

本研究結(jié)果表明HDP 能有效抑制A431 細胞增殖、遷移和侵襲并誘導(dǎo)細胞凋亡。提示HDP 在皮膚鱗癌治療中可能起積極抗腫瘤作用。

miRNA 在腫瘤中的抗癌或促癌作用已得到廣泛研究。Bruegger 等〔16〕分析了健康皮膚細胞和皮膚鱗癌細胞中miRNA 表達的差異，發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-31、miR-205 在皮膚鱗癌細胞中顯著上調(diào)，作為癌基因參與皮膚鱗癌的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果提示HDP 對A431 細胞的作用可能與抑制miR-21-5p表達有關(guān)。

PAG1 是一種跨膜接頭蛋白，研究認為PAG1 可通過調(diào)節(jié)Src 家族成員激酶活性參與腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)化等病理過程〔17，18〕。李美佳等〔19〕報道，PAG1過表達通過抑制皮膚鱗癌細胞移動能力而抑制其遷移和侵襲。本研究結(jié)果說明抑制PAG1 后HDP 對A431 細胞生物學(xué)行為的影響減弱，提示HDP 是通過抑制A431 細胞中miR-21-5p 表達，進而靶向上調(diào)PAG1 表達而發(fā)揮作用。