黃麗麗 吳強 石偉榮 閆超

（福建中醫(yī)藥大學(xué) 1 附屬第二人民醫(yī)院腎內(nèi)科,福建 福州 350003;2 附屬人民醫(yī)院傳統(tǒng)病房）

糖尿病腎病是指糖尿病引起的腎臟微血管并發(fā)癥，其特點是蛋白尿和腎功能進行性減退，最終進展到終末期腎病，已成為糖尿病患者死亡的主要原因之一〔1〕。黃葵膠囊的主要成分是黃蜀葵花，具有利尿通淋、消腫解毒的作用〔2〕。有研究證明，黃葵膠囊可降低糖尿病腎病循環(huán)系統(tǒng)免疫復(fù)合物，此外還可利水消腫和降低尿蛋白〔3〕。但黃葵膠囊對糖尿病腎病的作用和機制尚未完全闡明。本研究使用高糖刺激腎小管上皮細胞模擬糖尿病腎病體外模型，旨在探究黃葵膠囊對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷的作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株:人腎小管上皮HK-2 細胞，購自美國ATCC。藥品與試劑:黃葵膠囊，規(guī)格:0.34 g/粒，生產(chǎn)批 號:20012909，國藥準 字:Z19990040。江蘇蘇中藥業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)。DMEM 低糖液體培養(yǎng)基、DMEM 高糖液體培養(yǎng)基和CCK-8 試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)；胎牛血清，美國ThermoFisherScientific 公司生產(chǎn)；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；腫瘤壞死因子（TNF）-α 和白細胞介素（IL）-6、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒，欣博盛生物科技有限公司生產(chǎn)；一抗兔多克隆抗體神經(jīng)源性位點缺口同源蛋白（Notch）1，兔單克隆抗體Hes1，兔單克隆抗體蛋白鋸齒（Jagged）1，兔多克隆抗體GAPDH，二抗山羊抗兔IgG H&L，英國Abcam 公司生產(chǎn)。儀器:PR4100 酶標儀，美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；EVOS 熒光顯微鏡，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.2 細胞分組與培養(yǎng) 將1 g 黃葵膠囊粉末溶于1 ml生理鹽水中，制備成濃度為1 g/ml 的混懸液。根據(jù)參考文獻〔4〕方法操作，將HK-2 細胞接種于含低糖（5.6 mmol/L D-葡萄糖）DMEM 的培養(yǎng)基中，在37℃，含5%CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合達80%時，加入0.25%胰酶消化4 min，然后取1×106個細胞接種于新的培養(yǎng)基，將HK-2 細胞隨機分成對照組（含5.6 mmol/L D-葡萄糖）、高糖組（含25 mmol/L D-葡萄糖）、實驗組（含25 mmol/L D-葡萄糖和1 g/ml 黃葵膠囊粉末混懸液）。

1.3 以ELISA 測定HK-2 細胞TNF-α 和IL-6 含量 根據(jù)參考文獻〔5〕的方法，收集各組細胞上層清液，置于EP 管中，然后離心，將上清液移至新的EP管中。按ELISA 說明書要求設(shè)置空白孔、標準孔和待測樣品孔。封板后于37℃孵育箱孵育，90 min 后甩干，每孔加入350 μl 洗滌液，30 s 后甩干，重復(fù)5 次。除空白孔，其余孔加入酶結(jié)合物稀釋液100 μl，于37℃孵育箱孵育避光15 min 后，向每孔加入終止液100 μl，用酶標儀測量各孔450 nm 處的吸光度，根據(jù)標準曲線得出各組上清液IL-6 和TNF-α 的濃度。

1.4 以CCK-8 實驗檢測HK-2 細胞存活率〔6〕取各組HK-2 細胞用胰蛋白酶消化后計數(shù)，以每孔5 000個細胞的密度接種于96 孔板上，隨后于每孔加入10 μl CCK-8 溶液，另設(shè)置空白孔，將96 孔板置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h 后，用酶標儀測量450 nm處OD 值，根據(jù)公式計算細胞存活率。細胞存活率=〔（實驗組OD 值-空白組OD 值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）〕×100%

1.5 以TUNEL 法檢測HK-2 細胞凋亡率 根據(jù)參考文獻〔7〕的方法，將HK-2 細胞接種于48 孔板，24 h后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，棄去PBS，用免疫染色固定液固定30 min，30 min 后棄去細胞固定液，PBS 洗滌，用Triton 孵育5 min，PBS 洗滌，隨后用TUNEL 工作液避光孵育1 h，用PBS 洗去TUNEL工作液，DAPI 復(fù)染，隨后于每孔滴加熒光淬滅劑，最后在熒光顯微鏡下拍照記錄。

1.6 以Western 印跡檢測HK-2 細胞Notch1、Hes1、Jagged1 表達〔8〕收集對照組、高糖組和實驗組人腎小管上皮細胞，于冰上加入裂解液，30 min 后刮取細胞，離心，提取上層清液為細胞總蛋白，用BCA 蛋白試劑盒定量，取50 μg 總蛋白，煮沸樣本5 min，離心后上樣，于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)于聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%BSA 封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，第2 天加入二抗室溫孵育2 h，洗膜3 次后即用電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色劑曝光，使用Quantity One 分析目的條帶灰度值。其中一抗稀釋濃度分別為:Notch1（1 ∶1 000）、Hes1（1 ∶1 000）、Jagged1（1 ∶1 000）、GAPDH（1 ∶1 000），二抗稀釋濃度為1 ∶2 000。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件進行One-way ANOVA 檢驗、LSD 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組HK-2 細胞TNF-α 和IL-6 含量比較 與對照組相比較，高糖組TNF-α、IL-6 濃度顯著增高（P＜0.05），與高糖組相比較，實驗組TNF-α、IL-6 濃度顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組IL-6 和TNF-α 含量比較(,pg/ml,n=7)

表1 各組IL-6 和TNF-α 含量比較(,pg/ml,n=7)

與對照組比較:1）P＜0.05；與高糖組比較:2）P＜0.05

2.2 各組HK-2 細胞的存活率比較 與對照組〔（100.00±0.00）%〕相比較，高糖組HK-2 細胞的存活率〔（76.52±5.14）%〕顯著降低，與高糖組相比較，實驗組〔（91.33±7.12）%〕顯著增高（均P＜0.05）。

2.3 各組HK-2 細胞凋亡率比較 與對照組〔（8.21 ±0.74）%〕 相比較，高糖組細胞凋亡率〔（17.43±1.26）%〕顯著增高；與高糖組比較，實驗組〔（11.53±1.27）%〕顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 TUNEL 法檢測各組細胞凋亡率(DAPI,×200)

2.4 黃葵膠囊對各組HK-2 細胞Notch1、Hes1 和Jagged 1 蛋白表達的影響 對照組、高糖組和實驗組Notch1 相對表達量分別為（0.92±0.08、2.33±0.17、1.32±0.11）；Hes1 相對表達量分別為（0.74±0.09、2.47±0.21、1.37±0.15）；Jagged1 相對表達量分別為（0.54±0.07、2.67±0.22、1.29±0.11）。與對照組相比較，高糖組Notch1、Hes1 和Jagged1 相對表達量顯著增高（P＜0.05）；與高糖組相比較，實驗組Notch1、Hes1 和Jagged1 相對表達量顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細胞中Notch1、Hes1 和Jagged1 的相對表達

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病最常見、最嚴重的慢性并發(fā)癥。既往研究顯示炎癥與糖尿病腎病密切相關(guān)，在高糖環(huán)境里，腎小管上皮細胞IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子釋放會增加，直接促使腎小管上皮細胞損傷〔5〕。黃葵膠囊可用于治療腎病綜合征、糖尿病腎病、原發(fā)性腎小球腎炎〔9〕。有研究表明黃葵膠囊能通過減輕炎癥反應(yīng)、下調(diào)致纖維化細胞因子表達、抑制氧化應(yīng)激和減少糖基化終末產(chǎn)物改善糖尿病腎病〔10〕。Notch 信號通路是一條高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，該通路參與急性腎損傷、腎小球病變、腎腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。在糖尿病腎病中，Notch 信號通路的過度激活會導(dǎo)致足細胞損傷引起腎小球病變，同時還會誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)因子Snai2 表達，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生，引起腎小管間質(zhì)纖維化〔11〕。另外，在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞中，Notch 信號通路Hes1、Jagged1 和Notch1 蛋白會呈現(xiàn)高表達〔12，13〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃葵膠囊會抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞TNF-α 和IL-6 炎癥因子的分泌，同時提高HK-2 細胞存活率，抑制凋亡率，并降低Notch 信號通路中Notch1、Hes1 和Jagged1 蛋白的表達。

綜上，黃葵膠囊能顯著抑制腎小管上皮細胞炎癥因子的分泌，并通過降低Notch 信號通路相關(guān)蛋白表達，來減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷。然而本研究僅限于體外實驗，今后將開展體內(nèi)實驗進一步驗證該結(jié)論。