高淼 劉莉 關(guān)阿娜 王俊霞

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,內(nèi)蒙古 包頭 014030）

宮頸癌是全世界女性中最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致全世界女性腫瘤相關(guān)死亡的常見(jiàn)惡性腫瘤〔1〕。雖然宮頸癌的篩查和早期診斷技術(shù)有所提高，但由于感染、性生活過(guò)早和人口老齡化等多種因素導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)病率仍高居不下，同時(shí)宮頸癌的長(zhǎng)期預(yù)后并未得到改善，因此宮頸癌新的治療手段仍需不斷探索〔2〕。微小RNA（miRNA）是小型非編碼RNA 家族，其表達(dá)失調(diào)可改變多個(gè)細(xì)胞和生物學(xué)過(guò)程，從而通過(guò)影響腫瘤生物學(xué)的多個(gè)方面來(lái)促進(jìn)人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔3〕。研究報(bào)道在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的miRNA 中，miR-137 依據(jù)不同的癌癥類型既表現(xiàn)出致癌作用，又表現(xiàn)出腫瘤抑制作用〔4，5〕，而在宮頸癌中miR-137 通過(guò)與GREM1 結(jié)合抑制細(xì)胞侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程〔6〕，miRNA 通過(guò)調(diào)控各種靶基因而發(fā)揮不同的作用〔7〕，而本文發(fā)現(xiàn)無(wú)翅和整合位點(diǎn)生長(zhǎng)因子（Wnt）5a 是miR-137 的靶基因之一，Wnt5a 是調(diào)控腫瘤惡性增殖的經(jīng)典信號(hào)通路Wnt/β-catenin 的重要成員之一〔8〕，其高表達(dá)促進(jìn)腫瘤的惡性增殖〔9〕，因此本文研究miR-137 靶向Wnt5a 抑制宮頸癌生長(zhǎng)的作用并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探討，為miR-137 作為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料 宮頸癌細(xì)胞HeLa、C33A、Caski 和永生化宮頸上皮細(xì)胞H8（ATCC，美國(guó)）；DMEM-高糖培養(yǎng)基、MEM 培養(yǎng)基、RPMI1640 培養(yǎng)基、DMEM-F12 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS，Gibco，美國(guó)）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas，美國(guó)）；RNA 提取試劑盒和qPCR 試劑盒（北京天根生化，中國(guó)）；miR-137、Wnt5a、內(nèi)參U6 和GAPDH 引物（上海生工，中國(guó)）；miR-137 mimic、過(guò)表達(dá)Wnt5a 質(zhì)粒、pGLO-Wnt5a-wt（野生型）和pGLO-Wnt5a-mut（突變型，上海吉?jiǎng)P，中國(guó)）；雙熒光素酶報(bào)道基因試劑盒和蛋白裂解液（上海碧云天，中國(guó)）；CCK8 試劑（北京東仁，中國(guó)）；EdU 增殖實(shí)驗(yàn)試劑盒（廣州奧博，中國(guó)）；Wnt5a 和β-catenin 抗體（Abcam，英國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌細(xì)胞和永生化宮頸上皮細(xì)胞快速?gòu)?fù)蘇后重懸至含有10%FBS 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM-高糖、C33A 細(xì)胞培養(yǎng)基為MEM、Caski 細(xì)胞培養(yǎng)基為RPMI1640，H8 細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM-F12。細(xì)胞融合度為90%時(shí)，胰酶消化后傳代，取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 qPCR 收集細(xì)胞，加入Trizol 裂解液，采用RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，采用7 500 qPCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 s，95℃變性5 s、65℃退火30 s 共40 個(gè)循環(huán)。檢測(cè)各樣品的循環(huán)閾值（Ct），以U6 為內(nèi)參計(jì)算miR-137相對(duì)表達(dá)量，GAPDH 為內(nèi)參計(jì)算Wnt5a mRNA 相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為2-ΔΔCt。miR-137 引物序列正義鏈:5＇-TTATTGCTTAAGAATACGCGTAG-3＇，反義鏈:5＇-TGGTGTCGTGGAGTCG-3＇。U6 引物序列正義鏈:5＇-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3＇，反義鏈:5＇-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3＇。Wnt5a 引物序列正義鏈:5＇-ATTCTTGGTGGTCGCTAGGTA-3＇，反義鏈:5＇-CGCCTTCTCCGATGTACTGC-3＇。GAPDH 引物序列正義鏈:5＇-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3＇，反義鏈:5＇-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3＇。

1.3.2 miR-137 靶向調(diào)控Wnt5a 的驗(yàn)證 TargetScan7.1 軟件（http://www.targetscan.org/）預(yù)測(cè)miR-137 的靶基因。以3 000 個(gè)HeLa 細(xì)胞/孔接種到96 孔板中，分為Wnt5a-wt+NC 組、Wnt5a-wt+miR-137 mimic 組、Wnt5a-mut+NC 組和Wnt5a-mut+miR-137 mimic 組，細(xì)胞貼壁12 h 時(shí)采用脂質(zhì)體2000 將各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至細(xì)胞中。收集轉(zhuǎn)染48 h 的各組細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)道基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3.3 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 選取miR-137 表達(dá)最低的宮頸癌細(xì)胞，以2×105個(gè)接種至6 孔板中，分為NC 組、miR-137 mimic 組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a（過(guò)表達(dá)Wnt5a 質(zhì)粒）組。細(xì)胞貼壁12 h 時(shí)采用脂質(zhì)體2000 將各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至細(xì)胞中，6 h 換液。

1.3.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 選取miR-137 表達(dá)最低的宮頸癌細(xì)胞，以2 000 個(gè)接種至96 孔板中，分為NC組、miR-137 mimic 組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a組，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。按上述方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 時(shí)加入10 μl CCK8 試劑，培養(yǎng)箱中孵育1 h。采用全波長(zhǎng)掃描儀檢測(cè)OD 值（450 nm）。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)孔OD 值/對(duì)照孔OD 值×100%。

1.3.5 平板克隆實(shí)驗(yàn) 選取miR-137 表達(dá)最低的宮頸癌細(xì)胞，以400 個(gè)接種至6 孔板中，分為NC組、miR-137 mimic 組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。按上述方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞克隆團(tuán)肉眼可見(jiàn)時(shí)終止培養(yǎng)，去掉培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3 次，甲醇固定，吉姆薩染色后計(jì)數(shù)。

1.3.6 EdU 實(shí)驗(yàn) 選取miR-137 表達(dá)最低的宮頸癌細(xì)胞，以2 000 個(gè)接種至24 孔板中，分為NC 組、miR-137 mimic 組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。按上述方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后，去掉培養(yǎng)基，PBS 洗3 次，甲醛固定，采用EdU 試劑盒染色后計(jì)算EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.3.7 Western 印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液，裂解后以超高速低溫離心，獲得全蛋白上清液，加入上樣緩沖液煮沸變性后，采用凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，8%的脫脂牛奶封閉聚偏氟乙烯（PVDF）膜，4℃一抗孵育過(guò)夜，室溫二抗孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光法（ECL）曝光。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌細(xì)胞系中miR-137 和Wnt5a 的表達(dá) miR-137 在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)均顯著高于永生化宮頸上皮細(xì)胞H8，在HeLa 細(xì)胞中表達(dá)最高（P＜0.05），選擇其進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Wnt5a 在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)均顯著低于永生化宮頸上皮細(xì)胞H8（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 miR-137 和Wnt5a 在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)(,n=3)

表1 miR-137 和Wnt5a 在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)(,n=3)

與H8 組比較:1）P＜0.05

2.2 miR-137 對(duì)Wnt5a 的靶向調(diào)控作用 TargetScan7.1 軟件在線預(yù)測(cè)顯示W(wǎng)nt5a 啟動(dòng)子區(qū)與miR-137 具有結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖1。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示:與Wnt5a-wt+NC 共轉(zhuǎn)染組熒元素酶活性（1.00±0.02）相比，Wnt5a-wt+miR-137 顯著降低（0.42±0.11，t=8.985，P＜0.05）；而Wnt5a-mut+NC 組熒光素酶活性（0.98 ±0.02）與Wnt5a-mut +miR-137（0.96±0.05）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.653，P=0.549）。與NC 組Wnt5a mRNA 表 達(dá)（1.00 ±0.02）相比，miR-137 mimic 組（0.29±0.04）和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組（0.48±0.03）均顯著降低，且miR-137 mimic 組顯著低于miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組（均P＜0.05）。表明miR-137 靶向負(fù)調(diào)控Wnt5a。

圖1 Wnt5a 啟動(dòng)子區(qū)與miR-137 結(jié)合位點(diǎn)

2.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 與NC 組相比，miR-137 mimic組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細(xì)胞增殖活性顯著降低（P＜0.05）。而與miR-137 mimic 組相比，miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細(xì)胞增殖活性顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)表2。表明Wnt5a 減弱miR-137 對(duì)細(xì)胞增殖活性的抑制作用。

表2 miR-137 靶向Wnt5a 對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(,n=3)

表2 miR-137 靶向Wnt5a 對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(,n=3)

與NC 組比較:1）P＜0.05；與miR-137 mimic 組比較:2）P＜0.05

2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn) 與NC 組相比，miR-137 mimic組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細(xì)胞平板克隆形成能力顯著降低（P＜0.05）。而與miR-137 mimic組相比，miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細(xì)胞平板克隆形成顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)表2，圖2。表明Wnt5a減弱miR-137 對(duì)細(xì)胞平板克隆形成能力的抑制作用。

圖2 miR-137 調(diào)控Wnt5a 抑制HeLa 細(xì)胞克隆形成能力(吉姆薩染色,×100)

2.5 EdU 實(shí)驗(yàn) 與NC 組相比，miR-137 mimic 組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細(xì)胞Edu 陽(yáng)性細(xì)胞率顯著降低（P＜0.05）。而與miR-137 mimic 組相比，miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細(xì)胞Edu 陽(yáng)性細(xì)胞率顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)表2，圖3。表明Wnt5a 減弱miR-137 對(duì)細(xì)胞增殖能力的抑制作用。

圖3 免疫熒光染色觀察miR-137 調(diào)控Wnt5a 降低HeLa 細(xì)胞EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率(×200)

2.6 miR-137 調(diào)控Wnt5a 對(duì)wnt/β-catenin 信號(hào)通路的影響 與NC 組相比，miR-137 mimic 組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細(xì)胞中Wnt5a 和β-catenin蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而與miR-137 mimic組相比，miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細(xì)胞中wnt5a和β-catenin 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)表2，圖4。表明Wnt5a 減弱miR-137 對(duì)細(xì)胞Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的抑制作用。

圖4 miR-137 靶向調(diào)控Wnt5a 抑制wnt/β-catenin 信號(hào)通路的活化

3 討論

宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多步驟過(guò)程，由宮頸炎癥發(fā)展為宮頸上皮內(nèi)瘤變，最終進(jìn)展為宮頸癌，其中人乳頭瘤病毒是導(dǎo)致初始宮頸癌變的主要因素，除此慢性宮頸炎、多次分娩和吸煙等均是宮頸癌的高危因素，但是宮頸癌發(fā)病的確切機(jī)制仍不清楚〔10〕。目前宮頸癌的治療常用手段包括手術(shù)、化療和放射療法，但是這些治療策略對(duì)于晚期的宮頸癌患者的治療療效有限，但是宮頸癌的早期常見(jiàn)癥狀為不規(guī)則陰道流血，常常被患者忽視，導(dǎo)致大多數(shù)患者確診時(shí)已處于腫瘤晚期，因此宮頸癌患者的5 年生存率仍然很低〔2〕。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的研究進(jìn)展，分子靶向藥物已經(jīng)成為抗腫瘤治療的研究熱點(diǎn)，研究報(bào)道表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）特異性單克隆抗體和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）抑制劑等分子靶向藥物在宮頸癌治療的臨床試驗(yàn)中取得了顯著療效，表明分子靶向藥物治療宮頸癌有較好的應(yīng)用前景〔11〕。

miRNA 是保守非編碼RNA 的重要一大類，長(zhǎng)度只有20～22 個(gè)核苷酸，miRNA 的異常表達(dá)會(huì)影響包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、血管生成、侵襲和遷移等生物學(xué)行為〔3〕。miRNA 的失調(diào)是宮頸癌發(fā)病進(jìn)展的常見(jiàn)驅(qū)動(dòng)力，越來(lái)越多異常的miRNA 在宮頸癌中被發(fā)現(xiàn)〔12〕。miR-137 是宮頸癌中新近發(fā)現(xiàn)的miRNA 之一，Miao 等〔6〕報(bào)道m(xù)iR-137 在宮頸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-137 抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、克隆形成能力、侵襲和轉(zhuǎn)移及裸鼠的成瘤能力，其作用機(jī)制是通過(guò)與GREM1 結(jié)合抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β/ smad 途徑的激活。miRNA通過(guò)與靶基因mRNA 的3＇-UTR 發(fā)生堿基配對(duì)，導(dǎo)致mRNA 的穩(wěn)定化并促進(jìn)mRNA 的降解，每個(gè)miRNA 的靶基因存在數(shù)個(gè)至數(shù)百個(gè)〔7〕，報(bào)道m(xù)iR-137在宮頸癌中通過(guò)靶向GREM1 發(fā)揮抑癌作用〔6〕，在前列腺癌中通過(guò)靶向TRIM24 抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力〔13〕。

Wnt5a 在人類腫瘤中為癌基因，屬于分泌性糖蛋白Wnt 家族中的亞型，Wnt5a 在宮頸癌中表達(dá)增加，促進(jìn)宮頸癌的增殖〔14〕，本研究發(fā)現(xiàn)miR-137 在宮頸癌細(xì)胞系中表達(dá)降低，wnt5a 在宮頸癌細(xì)胞系中表達(dá)增加，與已有的研究報(bào)道一致〔6，14〕。研究顯示W(wǎng)nt5a 既可激活依賴β-catenin 經(jīng)典Wnt 信號(hào)途徑，又可激活不依賴β-catenin 非經(jīng)典Wnt 信號(hào)途徑的關(guān)鍵因子〔8〕，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是調(diào)控惡性腫瘤增殖的重要調(diào)控途徑，且宮頸癌中Wnt/β-catenin 處于高度激活狀態(tài)〔15〕，本研究結(jié)果表明在宮頸癌中miR-137 靶向Wnt5a 可能通過(guò)降低Wnt/βcatenin 信號(hào)途徑的活化抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

綜上，宮頸癌細(xì)胞系中miR-137 表達(dá)降低，Wnt5a 表達(dá)增加，miR-137 靶向Wnt5a 抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，可能通過(guò)降低Wnt/β-catenin 信號(hào)途徑的活化。