王志敏 林純意 易高

（廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院 1 重癥醫(yī)學科,廣東 廣州 510700;2 呼吸內(nèi)科）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種常見的以持續(xù)氣流受限為特征的慢性炎癥性肺部疾病，以肺彈性減小、氣道和肺泡結(jié)構(gòu)改變引起缺氧和（或）二氧化碳潴留為主要特點〔1〕，主要累及肺實質(zhì)、肺血管及氣道〔2〕。COPD 后期可繼發(fā)肺動脈高壓，具有很高的患病率及病死率〔3，4〕。研究顯示炎癥反應是COPD 發(fā)生的主要原因之一，炎癥細胞被激活后釋放大量炎癥因子浸潤氣道和肺組織，最終引起呼吸系統(tǒng)組織結(jié)構(gòu)破壞，進一步參與COPD 的發(fā)生發(fā)展〔5〕。丹參酮ⅡA 磺酸鈉是從丹參中分離出二萜醌類化合物丹參酮后經(jīng)磺化得到的水溶性物質(zhì)，具有抗氧化、抗菌抗炎、抗凝血作用和抑制氣道重塑等多種生物活性〔6〕。本研究探討丹參酮ⅡA 磺酸鈉對老年COPD 模型大鼠的治療作用及其作用機制為其在臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD 大鼠62 只，SPF 級，雄性，22～24 周齡，體重250～300 g，由廣東省動物實驗中心提供，動物合格證號為SCXK（粵）2013-0002。實驗開始前先適應性喂養(yǎng)1 w，動物房溫度23～27℃，相對濕度45%～55%，晝夜時間12 h/12 h，用標準大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲用純凈水。

1.1.2 主要藥物或試劑 丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司，國藥準字H31022558）；脂多糖（LPS，美國Sigma 公司），中南海牌過濾嘴香煙（北京卷煙廠:焦油含量12 mg，煙堿量1.0 mg，一氧化碳量13 mg），腫瘤壞死因子（TNF）-α 試劑盒、白細胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8 和IL-18（武漢博士德生物工程有限公司）；TRIZOL 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）試劑，由天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)；磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗體（美國BD Biosciences 公司）；RIPA 裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、兔抗鼠β-actin 抗體、HRP-羊抗大鼠IgG、ECL Prime 蛋白印跡試劑，均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。PI3K、AKT、mTOR 和內(nèi)參β-肌動蛋白（β-actin）引物設計與合成由天根生化科技（北京）有限公司完成，引物序列見表1。

1.1.3 主要儀器 -80℃超低溫冰箱（青島海爾電冰箱有限公司），自制煙霧暴露裝置，Buxco 動物肺功能分析系統(tǒng)（北京華運安特科技有限責任公司），Thermo CL31R 型離心機（美國Thermo 公司），超微量分光光度計（北京凱奧科技公司），ABI step one熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司），GeneGenius 全自動凝膠成像系統(tǒng)（美國Syngene 公司），Western 印跡電泳儀（美國BIO-RAD 公司），F(xiàn)luor Chem Q 蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)（美國Alpha 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 COPD 動物模型的制備 隨機選擇12 只大鼠作為正常對照組，其余50 只大鼠采用氣管注入LPS 和吸入香煙煙霧法制備COPD 模型。第1 天各大鼠經(jīng)10%水合氯醛（100 g/0.25 ml）腹腔麻醉，氣管內(nèi)注射1 mg/ml LPS 100 μl，以軸位旋轉(zhuǎn)大鼠數(shù)次。于第2～28 天將各大鼠在100 cm×80 cm×80 cm有機玻璃密閉箱進行煙熏，每次同時點燃香煙8 支，30 min/次，2 次/d。熏煙后立刻將大鼠移至15℃低溫環(huán)境，冷空氣刺激1 h，模型復制28 d 結(jié)束。造模結(jié)束后隨機取2 只做肺部病理切片，確認造模成功。

1.2.2 分組與給藥 造模結(jié)束時將COPD 大鼠按隨機數(shù)字表分為模型對照組、丹參酮ⅡA 大劑量組、中劑量組和小劑量組，每組各12 只，另未造模的12只大鼠作為正常對照組。丹參酮ⅡA 大劑量組、中劑量組和小劑量組分別腹腔內(nèi)注射丹參酮ⅡA 磺酸鈉10.0 mg/kg、5.0 mg/kg 和2.5 mg/kg，正常對照組和模型對照組大鼠腹腔注射同體積的生理鹽水，1 次/d，共14 d。

1.2.3 檢測指標 末次給藥后1 h 測定各組大鼠肺功能、支氣管肺泡灌洗液中細胞計數(shù)、血清炎癥細胞因子水平、肺組織PI3K/AKT 信號通路基因和蛋白的表達。

1.2.3.1 肺功能測定 各組大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉0.3 ml/100 g 麻醉，仰臥位固定，暴露氣管，行氣管插管后與小動物肺功能檢查儀器的皮管聯(lián)接，測定各組大鼠肺功能指標，包括用力肺活量（FVC），第0.3 秒用力呼氣容積（FEV0.3）和最大呼氣流量（PEF），計算FEV0.3/FVC。

1.2.3.2 血清炎癥因子水平測定 肺功能測定結(jié)束后打開腹腔并暴露腹主靜脈。經(jīng)腹主靜脈抽血1 ml，室溫下靜止至血液完全凝固后離心（3 000 r/min×10 min），采用雙抗體一步夾心法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平。具體操作嚴格按照說明書進行。

1.2.3.3 支氣管肺泡灌洗液細胞計數(shù) 各組大鼠脫臼處死，打開胸腔，分離氣管和雙肺。在氣管下部做橫切口，分別用止血夾關閉左、右主支氣管，通過氣管插管術收集肺泡灌洗液（BALF），用注射器分3次緩慢注入4℃冷PBS，2 ml/次，緩慢回吸收集BALF，回收液為80%～90%。BALF 于4℃下離心（3 000 r/min×10 min），然后用2 ml PBS 重懸細胞沉淀，采用血細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，并經(jīng)Wright染色對中性粒細胞和巨噬細胞進行分類計數(shù)。

1.2.3.4 RT-PCR 測定肺組織PI3K/AKT 信號通路基因的表達 取右肺后葉及副葉在液氮中研磨，加Trizol 試劑提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成得cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系:10 mmol/L 脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）1 μl，隨機引物2 g，5×緩沖液4 μl，二硫蘇糖醇（DTT，100 mmol/L）2 μl，核糖核酸酶抑制劑（RNAsin）1 μl，莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶（MMLVRT）反轉(zhuǎn)錄酶1 μl。逆轉(zhuǎn)錄條件:37℃50 min，70℃15 min。將所得cDNA 于-80℃保存。進行PCR 前先將cDNA 室溫下解凍，純化后進行PCR 擴增。PCR 體系:cDNA 模板2 μl，目標基因上游引物和下游引物各2 μl，Super Real Pre Mix Plus 10 μl，加入純化H2O 至20 μl。PCR 條件:95℃預變性10 s，然后以95℃10 s、90℃5 s、60℃20 s、40 個循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt計算目標基因PI3K、AKT、mTOR 的相對表達量。

1.2.3.5 Western 印跡測定肺組織PI3K/AKT 信號通路蛋白的表達 取左肺后葉及副葉，切成米粒大小，加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑，使肺組織裂解，于4℃離心（12 000 r/min×10 min），分離得可溶性蛋白，用BCA 法進行蛋白定量，于-20℃保存。進行測量前先將蛋白室溫下解凍，100℃變性10 min。取10 μl 上樣，用10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂奶粉（磷酸化抗體用4% BSA）封閉2 h，分別加入PI3K、AKT、mTOR 和β-actin 一抗，4℃下孵育過夜。PBST 溶液洗膜3 次，加入IgG-HRP，室溫避光孵育1 h，PBST 溶液洗膜3 次。加ECL 液曝光、顯影、定影。用掃描儀掃描曝光膠片，用Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.2.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0 軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組肺功能比較 模型對照組大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC 和PEF 均較正常對照組顯著降低（P＜0.05）。丹參酮ⅡA 小劑量組和模型對照組FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC 和PEF 差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），丹參酮ⅡA 中劑量組FVC、FEV 0.3、FEV0.3/FVC 和PEF 均較模型對照組和丹參酮ⅡA 小劑量組顯著升高（P＜0.05），丹參酮ⅡA 大劑量組FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC 和PEF 均較模型對照組、丹參酮ⅡA 小劑量組和中劑量組顯著升高（P＜0.05）。見表2。

2.2 各組BALF 細胞計數(shù)比較 模型對照組BALF細胞總數(shù)、中性粒細胞和巨噬細胞均較正常對照組顯著升高（P＜0.05）。丹參酮ⅡA 小劑量組和模型組BALF 細胞總數(shù)、中性粒細胞和巨噬細胞計數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），丹參酮ⅡA 中劑量組BALF 細胞總數(shù)、中性粒細胞和巨噬細胞計數(shù)均較模型對照組和丹參酮ⅡA 小劑量組顯著降低（P＜0.05），丹參酮ⅡA 大劑量組BALF 細胞總數(shù)、中性粒細胞和巨噬細胞計數(shù)均較模型對照組、丹參酮ⅡA 小劑量組和中劑量組顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組肺功能指標和BALF 細胞計數(shù)的比較(,n=12)

表2 各組肺功能指標和BALF 細胞計數(shù)的比較(,n=12)

與正常對照組比較:1）P＜0.05；與模型對照組比較:2）P＜0.05；與丹參酮ⅡA 小劑量組比較:3）P＜0.05；與丹參酮ⅡA 中劑量組比較:4）P＜0.05；下表同

2.3 各組血清炎癥因子水平的比較 模型對照組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平均較正常對照組顯著升高（P＜0.05）。丹參酮ⅡA 小劑量組和模型對照組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），丹參酮ⅡA中劑量組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平較模型對照組和丹參酮ⅡA 小劑量組顯著降低（P＜0.05），丹參酮ⅡA 大劑量組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平均較模型對照組、丹參酮ⅡA 小劑量組和中劑量組顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組血清炎癥因子水平的比較(,n=12,ng/L)

表3 各組血清炎癥因子水平的比較(,n=12,ng/L)

2.4 各組肺組織PI3K/AKT 信號通路基因表達水平的比較 模型對照組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR mRNA 表達水平均較正常對照組顯著升高（P＜0.05）。丹參酮ⅡA 小劑量組和模型組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR mRNA 表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），丹參酮ⅡA 中劑量組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR mRNA 表達水平較模型對照組和丹參酮ⅡA 小劑量組顯著降低（P＜0.05），丹參酮ⅡA 大劑量組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR mRNA表達水平均較模型對照組、丹參酮ⅡA 小劑量組和中劑量組顯著降低（P＜0.05）。見表4。

2.5 各組肺組織PI3K/AKT 信號通路蛋白表達水平的比較 模型對照組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR 蛋白表達水平均較正常對照組顯著升高（P＜0.05）。丹參酮ⅡA 小劑量組和模型組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR 蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），丹參酮ⅡA 中劑量組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR 蛋白表達水平均較模型對照組和丹參酮ⅡA 小劑量組顯著降低（P＜0.05），丹參酮ⅡA 大劑量組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR 蛋白表達水平均較模型對照組、丹參酮ⅡA 小劑量組中劑量組顯著降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組肺組織PI3K/AKT 信號通路基因及蛋白表達水平的比較(,n=12)

表4 各組肺組織PI3K/AKT 信號通路基因及蛋白表達水平的比較(,n=12)

3 討論

COPD 的發(fā)病原因及其致病機制目前還不十分明確，吸煙是目前公認COPD 的最主要病因。煙草燃燒產(chǎn)生的有害顆粒及氧化物質(zhì)能直接損傷支氣管黏膜纖毛系統(tǒng)，引起支氣管痙攣，削弱呼吸道的防御能力和自凈能力，并且可活化肺組織中炎癥細胞，使其釋放包括基質(zhì)金屬蛋白酶在內(nèi)的多種蛋白酶類、大量氧自由基、氧化產(chǎn)物和多種炎癥因子。炎癥因子可促進肺組織損傷及氣道重塑。大量氧自由基和氧化產(chǎn)物使得細胞外基質(zhì)過多破壞降解，彈性纖維斷裂，逐漸破壞形成肺氣腫〔7，8〕。上述細胞和炎癥因子共同作用導致肺部慢性炎癥的產(chǎn)生，最終使肺部結(jié)構(gòu)改變〔9〕。丹參酮ⅡA 磺酸鈉具有抗氧化，降低血液黏度以抑制凝血、促進纖溶、抑制血小板聚集、延長血栓形成及促進血栓溶解作用等。近年來關于丹參酮ⅡA 磺酸鈉的抗炎特性越來越受到關注，并且在抑制組織重塑、凋亡、血管新生等方面具有一定作用〔10〕。已有關于丹參酮ⅡA 磺酸鈉對COPD 治療作用的研究〔6，11〕，但是對老年COPD 的治療作用卻未見報道。本研究結(jié)果顯示，丹參酮Ⅱ磺酸鈉可顯著改善老年COPD 大鼠的呼吸功能。

目前大多認為COPD 為慢性持續(xù)性炎癥性氣道疾病，而巨噬細胞、中性粒細胞、上皮細胞等是COPD 炎癥的主要參與細胞。機體發(fā)生COPD 時，肺不同部位的肺泡巨噬細胞、T 淋巴細胞和中性粒細胞表達增加，對各級支氣管系統(tǒng)的浸潤，聚集在支氣管周圍的炎癥細胞被激活釋放大量炎癥因子〔12〕，對氣道結(jié)構(gòu)細胞和促進中性粒細胞炎癥反應均產(chǎn)生重要影響。因此，計數(shù)BALF 中炎癥細胞數(shù)量可間接評估COPD 嚴重程度。本研究結(jié)果說明丹參酮Ⅱ磺酸鈉對老年COPD 大鼠的治療作用可能與其降低肺組織炎癥細胞有關。

炎癥因子在COPD 的炎癥反應中發(fā)揮重要作用。TNF-α 具有較強的抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及炎癥誘導作用〔13〕。IL-1β 主要由白細胞特產(chǎn)生，參與機體炎癥反應、免疫應答。同時，IL-1β 還可與其他炎性物質(zhì)相互誘導、共同作用，募集并激活炎性細胞〔14〕，引起其他炎性物質(zhì)的產(chǎn)生〔15〕。IL-6 主要由單核-巨噬細胞、B 淋巴細胞和T 淋巴細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞等分泌，與多種組織、細胞有親和力，能夠調(diào)節(jié)免疫應答、參與炎癥反應的功能〔16〕。IL-8 主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，可促使中性粒細胞活化和遷移，釋放炎癥介質(zhì)，可直接導致組織受到損害〔17〕。IL-18 主要由巨噬細胞分泌，在對病原體天然免疫的防御中起重要作用。IL-18 可誘導中性粒細胞并聚集至氣管、支氣管及肺組織，并產(chǎn)生氧自由基和水解酶，不斷加劇支氣管和肺內(nèi)的炎癥作用，最后導致COPD 發(fā)生〔18〕。本研究結(jié)果顯示，丹參酮Ⅱ磺酸鈉可劑量依賴性降低老年COPD 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平，說明丹參酮Ⅱ磺酸鈉對老年COPD 大鼠的治療作用可能與其降低上述炎癥因子水平有關。

PI3K/AKT 信號通路是細胞內(nèi)參與細胞炎癥、凋亡和自噬等經(jīng)典信號通路，參與COPD 的發(fā)展。PI3K 是一種可催化磷脂酰肌醇磷酸化的脂類激酶，AKT 是進化上高度保守的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mTOR 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是AKT 下游眾多的靶因子之一。激活PI3K 后使磷脂酰肌醇磷酸化，募集AKT 和PDK1 絲氨酸/蘇氨酸激酶，活化AKT 并激活mTOR，導致內(nèi)皮細胞增殖和分化，促進上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化〔19〕。香煙煙霧可誘導PI3K/AKT 磷酸化增加，導致COPD 患者小氣道纖維化〔20〕。本研究結(jié)果說明丹參酮Ⅱ磺酸鈉對老年COPD 大鼠的治療作用可能與其調(diào)節(jié)肺組織PI3K/AKT 信號通路基因和蛋白的表達有關。

綜上，丹參酮ⅡA 磺酸鈉可顯著改善老年COPD 大鼠的肺功能，其作用可能與其降低機體炎癥反應、調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路基因和蛋白的表達有關。