田迎 寧艷碩 王晶 張菊香 趙衛(wèi)國 王品 彭鈺紅 高春蕾

（1 哈勵遜國際和平醫(yī)院,河北 衡水 053000;2 河北醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院）

哮喘是一種由多種炎癥細胞和細胞因子參與調(diào)控的嚴重危害人和動物健康的慢性氣道炎癥性疾病，表現(xiàn)為慢性氣道炎癥，氣道功能下降和氣道重塑〔1〕。我國第3 次城市老年哮喘流行病學調(diào)查資料顯示，全國城市2010 年哮喘患病率為3.02%〔2〕，嚴重影響了患者的生命質(zhì)量和家庭幸福感。重癥哮喘患者即使使用高劑量糖皮質(zhì)激素和長效β2激動劑仍無法有效控制病情〔3〕。盡管重癥哮喘患者為數(shù)不多，但其所需的治療費用卻占哮喘總費用的一半〔4〕。目前針對重癥哮喘患者并沒有較為有效的治療方法。研究顯示，由CTNNA3 編碼的αT-鈣黏著蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（αT-cat）基因多態(tài)性與哮喘的惡化程度相關(guān)〔5，6〕。α-catenins 是鈣黏蛋白和細胞骨架的肌動蛋白絲之間的連接蛋白，是整個機體組織中主要的細胞黏附系統(tǒng)〔7〕。α-catenins 有3 種形態(tài)，即αE-cat、αN-cat 和αT-cat〔8〕。其中，αT-cat 在功能上似可有可無，小鼠敲除αT-cat 后仍可正常存活及繁殖〔9〕。然而，隨著年齡的增長及射血分數(shù)降低，這些基因敲除小鼠可發(fā)生心肌病，這與αT-cat 在心臟中富集表達是一致的〔10〕。文獻報道，αT-cat 在肺部也有表達，但在肺組織中表達更廣泛的是αE-cat，αT-cat 的表達極少，僅圍繞肺靜脈心肌細胞的細胞層〔11〕。在小鼠過敏性哮喘模型中，有研究者觀察到肺靜脈周圍總有炎癥發(fā)生〔12〕，但αT-cat 在調(diào)節(jié)氣道炎癥方面的作用目前尚不清楚。本研究采用卵清蛋白（OVA）誘導建立CTNNA3 敲低小鼠過敏性哮喘模型，研究CTNNA3 對過敏性小鼠哮喘模型中肺靜脈炎癥的影響，鑒于αT-cat 僅在肺靜脈周圍表達，假設(shè)αT-cat 通過調(diào)控肺靜脈周圍組織炎癥來參與氣道炎癥過程，以此探討CTNNA3 在調(diào)節(jié)哮喘發(fā)作中的具體作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 OVA 及αT-cat 單克隆抗體（#952）及硫酸鋁鉀（分析純）（美國 Sigma 公司）；PARIL30Y 高頻霧化器（德國百瑞公司）；多聚甲醛（天津市博愛化工）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒G1120（北京索萊寶）；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒白細胞介素（IL）-1β、IL-4、IL-10、干擾素（IFN）-γ（武漢博士德）；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（日本Takara 公司）；RT-PCR 引物、AAV-CTNNA3 腺相關(guān)病毒過表達重組載體（NM_001164376.1）、AAV-shCTNNA3 腺相關(guān)病毒敲低重組載體構(gòu)建及包被（上海生工生物），shCTNNA3 Oligo:上游引 物 5＇-CACCGCAGCAGTTACAAGACTCCTTGTTCT CGAAAGAACAAGGAGTCTTGTAACTGCTG-3＇，下游引 物5＇-AAAACAGCAGTTACAAGACTCCTTGTTCTTTCGAGAACAAGGAGTCTTGTAACTGCTGC-3＇。

1.2 實驗分組及OVA 哮喘模型制備 實驗分組:18～20 g C57BL/6 小鼠尾靜脈注射50 μl 重組腺病毒，敲低病毒注射（AAV-shCTNNA3）滴度為1×108PFU/ml，過表達病毒注射（AAV-CTNNA3）滴度5×108PFU/ml。實驗分組如下:control 組、AAV-shCTNNA3 組、control+OVA 組、AAV-shCTNNA3+OVA組、AAV-CTNNA3 及AAV-CTNNA3+OVA 組，每組9只，共54 只，在末次OVA 激發(fā)24 h 后對其進行氣道反應(yīng)檢測，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）、肺部灌洗液4℃保存并盡快對炎癥細胞數(shù)目及炎癥細胞因子IL-1β、IL-4、IL-10、IFN-γ 等指標進行測定，收集肺部氣道、肺及肺右上靜脈等組織進行液氮凍存，測定CTNNA3 表達、炎癥細胞因子等，以評價CTNNA3 對哮喘小鼠氣道炎癥的促進作用。

OVA 小鼠哮喘模型制備:參考文獻〔13，14〕。各組先進行1 w 的適應(yīng)性飼養(yǎng)。在第0、7、14 天，AAVshCTNNA3 組、AAV-shCTNNA3+OVA 組及AAV-CTNNA3+OVA 組均腹腔注射 OVA 致敏液（250 μg/ml），0.1 ml/只，而control 組、control+OVA組及AAV-CTNNA3 組注射等量的磷酸鹽緩沖液（PBS）。在第24～27 天，各組經(jīng)乙醚麻醉后滴鼻OVA 激發(fā)液，50 ml/只，并對致敏后進行激發(fā)的各組小鼠行為學觀察。

1.3 高頻振蕩法 末次OVA 激發(fā)24 h 后，各組通過Buxco 肺功能儀來測定氣道反應(yīng)性的強弱。具體方法為:利用2%戊巴比妥鈉鹽（55 mg/kg）麻醉小鼠進行氣管插管并連接小動物呼吸機，頻率2 000 r/min，潮氣量0.14～0.16 ml，以此測定各組小鼠的氣道壓力，并計算氣道阻力值（RI）。每次霧化之后均進行記錄。用來激發(fā)的乙酰甲膽堿（mCh）的濃度梯度為:0、5、10、25、50、100、200 mg/ml。測定結(jié)果進行分析，并進行數(shù)據(jù)處理。

1.4 支氣管肺泡灌洗（BAL）收集BALF:測定小鼠反應(yīng)性后，使用氣管插管到肺段，向支氣管肺泡內(nèi)快速注4℃預冷滅菌生理鹽水1 ml 后，在80～100 mmHg負壓下吸引回收液，反復灌洗2～3 次，收集1 ml BALF 進行細胞總數(shù)、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及淋巴細胞的分類計數(shù)。步驟如下:①BALF 細胞沉淀作涂片；②4%多聚甲醛固定，姬姆薩染液染色；③計數(shù)細胞，于顯微鏡下觀察細胞，根據(jù)細胞形態(tài)用白細胞分類計數(shù)器進行分類計數(shù)，每張片計數(shù)200 個細胞，最終細胞數(shù)=各類細胞總數(shù)×百分比；每組重復3 次；④在剩余細胞沉淀中加入預冷PBS，吹打混勻，吸取1 ml 用智能細胞計數(shù)器計數(shù)細胞總數(shù)，余下細胞進行ELISA 測定細胞因子。

1.5 實時熒光定量PCR 截取各組肺組織及右肺上靜脈段樣本約20 mg，分別用Trizol 勻漿提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，PCR 體系參考Takara 產(chǎn)品使用說明書，PCR 引物序列CTNNA3:正義鏈:5＇-AGCGAAATTGACTGCCCCAC-3＇，反義鏈:5＇-CTGACATGCTGCCTTTCTGTT-3＇；GAPDH:正 義鏈:55＇-GGAGTCCACTGGTGTCTTCA-3＇，反義鏈:5＇-GGGAACTGAGCAATTGGTGG-3＇。每個樣本3 個復孔，按兩步法PCR 擴增，條件為Step 1:95℃30 s；Step 2:95℃5 s，60℃30 s（40 cycles）。反應(yīng)結(jié)束后確認RT-PCR 的擴增曲線及溶解曲線是否滿足要求，儀器軟件中自動輸出Ct 值，計算相對表達量采用2-△△Ct方法。

1.6 Western 印跡 收集各組肺組織及右肺上靜脈段樣本，提取各組織中的總蛋白并測定蛋白濃度，處理好的待測樣品取50 μg 蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。封閉液室溫封閉1 h，經(jīng)一抗孵育后，4℃過夜。TBST充分洗膜后，加入二抗（1 ∶2 000）室溫孵育1 h，TBST 清洗后顯色液顯色照相。

1.7 HE 染色 各組小鼠在末次激發(fā)24 h 后取肺組織，于4%多聚甲醛中進行固定，經(jīng)酒精脫水、二甲苯通透后進行石蠟包埋，蠟塊切片厚度為0.8 μm。HE 染色后，在顯微鏡下對染色組織的炎癥情況進行觀察。

1.8 ELISA 取各組小鼠肺靜脈組織樣本，加入等體積蛋白裂解液將勻漿組織，離心取上清液，并按試劑盒說明書設(shè)置標準品、樣品及陰性對照等。按照劑盒說明書步驟處理收集樣本，用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的OD 值，觀察記錄結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0 軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組行為學觀察 control 組CTNNA3 mRNA水平（1.07 ±0.11）顯著高于AAV-shCTNNA3 組（0.39±0.15，P＜0.05），control 組aT-cat 蛋白水平（0.97±0.32）顯著高于AAV-shCTNNA3 組（0.47±0.07，P＜0.05）。見圖1。

圖1 Western 印跡檢測αT-cat 的表達

與control 組和AAV-shCTNNA3 組相比，control+OVA 組和AAV-shCTNNA3+OVA 組小鼠經(jīng)OVA 誘導后的行為學變化較大，激發(fā)過程中存在不同程度的抽搐、呼吸急促、煩躁不安等癥狀，激發(fā)第2 天則開始產(chǎn)生陽性反應(yīng)，大便次數(shù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，control組〔（5 ± 2）次/d〕 和 AAV-shCTNNA3 組〔（6 ±1）次/d〕顯著低于control+OVA 組〔（11±2）次/d，P＜0.05〕 和 AAV-shCTNNA3+OVA 組〔（13 ±3）次/d，P＜0.05〕；呼吸頻率統(tǒng)計結(jié)果顯示，control組〔（118±9）次/min〕和AAV-shCTNNA3 組〔（106±13）次/min〕 顯著低 于control+OVA 組〔（153 ±11）次/min，P＜0.05〕和AAV-shCTNNA3+OVA 組〔（146±3）次/min，P＜0.05〕。

2.2 抑制αT-cat 表達可緩解OVA 誘導的過敏性哮喘 mCh 濃度為0、5、10、25、50、100、200 mg/ml 時control 組和AAV-CTNNA3 組氣道阻力值差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；當mCh 濃度為0、5、10 mg/ml時，control+OVA 組和AAV-CTNNA3+OVA組氣道阻力值差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；當mCh 濃度為25、50、100、200 mg/ml 時，control+OVA 組氣道阻力值均顯著高于AAV-CTNNA3+OVA組（均P＜0.05），見表1。control 組和AAV-CTNNA3組炎性細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數(shù)目差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；control+OVA 組炎性細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數(shù)目均顯著高于AAV-CTNNA3+OVA 組（均P＜0.05）。見表2。表明下調(diào)CTNNA3 可能對過敏性哮喘模型小鼠有保護作用。

表1 各組氣道阻力值比較(,n=9,cmH2O·s/ml)

表1 各組氣道阻力值比較(,n=9,cmH2O·s/ml)

與control+OVA 組比較:1）P＜0.05；表2、3 同

表2 各組支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞數(shù)目比較(,n=9,×104 個/ml)

表2 各組支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞數(shù)目比較(,n=9,×104 個/ml)

2.3 抑制αT-catenin 表達顯著降低OVA 模型小鼠肺靜脈中的炎癥反應(yīng) control 組和AAV-CTNNA3組IL-1β、IL-4、IL-10、IFN-γ 差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；control+OVA 組IL-1β、IL-4 水平均顯著高于AAV-shCTNNA3+OVA 組，而IL-10、IFN-γ 水平均顯著低于AAV-shCTNNA3+OVA 組（均P＜0.05）。見表3、圖2。表明CTNNA3 可能在肺部靜脈組織OVA 激發(fā)情況下起著促進作用。

圖2 下調(diào)αT-cat 減緩OVA 誘導的過敏性哮喘(HE,×200)

表3 各組肺靜脈組織中免疫細胞因子表達水平比較(,n=9,pg/ml)

表3 各組肺靜脈組織中免疫細胞因子表達水平比較(,n=9,pg/ml)

2.4 增加CTNNA3 表達促進OVA 小鼠哮喘模型中肺靜脈炎癥 control 組CTNNA3 過表達后的mRNA相對表達量（1.05±0.08）顯著低于AAV-CTNNA3組（5.37±0.81，P＜0.05）。見圖3。未暴露于OVA中的CTNNA3 過表達小鼠AAV-CTNNA3 組炎癥因子IL-1β、IL-4 顯著高于control 組，IL-10、IFN-γ 顯著低于control 組（均P＜0.05）；而暴露于OVA 中的CTNNA3 過表達小鼠AAV-CTNNA3+OVA 組炎癥因子IL-1β、IL-4 顯著高于control+OVA 組，IL-10、IFNγ 顯著低于control+OVA 組（均P＜0.05）。見表4。

圖3 上調(diào)αT-cat 促進OVA 模型中肺靜脈炎癥

表4 各處理組肺靜脈組織中免疫因子表達(,n=9,pg/ml)

表4 各處理組肺靜脈組織中免疫因子表達(,n=9,pg/ml)

與control 組比較:1）P＜0.05；與control+OVA 組比較:2）P＜0.05

2.5 肺靜脈炎癥促進過敏性哮喘氣道炎癥的發(fā)生 control+OVA 組氣道炎癥明顯高于AAV-shCTNNA3+OVA 組，且與肺靜脈的距離越遠，兩組氣道炎性細胞數(shù)目均降低（P＜0.05），見表5、圖4。

表5 各組炎性細胞數(shù)目比較(,n=9)

表5 各組炎性細胞數(shù)目比較(,n=9)

與control+OVA 組比較:1）P＜0.05；與本組前一距離比較:2）P＜0.05

圖4 肺靜脈炎癥促進氣道炎癥的發(fā)生

3 討論

哮喘是一種由嗜酸性粒細胞浸潤為主并參與調(diào)控的慢性氣道炎癥〔15〕。哮喘治療不僅要對癥，更要控制潛在的氣道炎癥〔16〕。哮喘主要的防治方式是吸入糖皮質(zhì)激素。但重癥哮喘患者卻對這種激素治療方式有抵抗，無法有效控制病情〔3〕。研究數(shù)據(jù)顯示，攜帶αT-cat SNP 突變的哮喘患者對糖皮質(zhì)激素耐藥〔5〕。研究表明小鼠過敏性哮喘模型易引發(fā)肺靜脈炎癥〔6〕。本研究結(jié)果提示肺靜脈為中心的炎癥可能對氣道炎癥有顯著增強作用；小鼠哮喘模型中的肺靜脈炎癥促進了過敏性氣道炎癥的發(fā)生，提示αT-cat 在過敏性氣道炎癥的發(fā)生中有促進作用。

支氣管哮喘是一種常見的氣道慢性炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病〔17，18〕。研究顯示，支氣管哮喘的致病機制非常復雜，一般是在環(huán)境變應(yīng)原和遺傳因素雙重作用下影響Th1/Th2 細胞分化，導致哮喘的發(fā)生〔19〕。研究顯示支氣管哮喘氣道炎癥的發(fā)病機制存在許多信號通路及靶點，如sFRP2 通過Wnt/β-catenin 途徑促進COPD 氣道炎癥和Th17/Treg 失衡〔20〕。Brg1通過抑制PI3K/Akt/mTOR 通路加重哮喘氣道炎癥〔21〕。Rho 激酶抑制劑〔22〕、Sirtuins〔23〕等參與了支氣管哮喘發(fā)病過程，成為靶向治療支氣管哮喘的新靶點。本研究表明由CTNNA3 基因編碼的αT-cat在調(diào)節(jié)支氣管哮喘方面發(fā)揮重要作用，有望成為哮喘治療藥物研發(fā)的潛在靶點。

目前治療支氣管哮喘主要是集中在癥狀緩解，尚無治愈支氣管哮喘的方法〔24，25〕。研究表明多種中藥制劑及活性化合物通過調(diào)控TGF-β、NF-κB 等炎癥信號的表達參與哮喘氣道炎癥。馬黃湯通過TLR9 通路改善支氣管哮喘癥狀〔26〕。表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過TGF-β1 通路改善哮喘小鼠氣道炎癥〔27〕。魚藤素通過抑制NF-κB 通路減輕小鼠過敏性氣道炎癥〔28〕。方消方通過抑制TGF-β/Smad3信號通路減輕哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑〔29〕。上述研究表明支氣管哮喘的治療除了對中藥復方及各種生物活性化合物的篩選外，其主要發(fā)病機制的研究及治療靶點的發(fā)現(xiàn)也十分關(guān)鍵。