趙學萍 孟憲勇 張晗 董曉華

（河北北方學院 1 神經(jīng)藥理學重點實驗室,河北 張家口 075000;2 附屬第一醫(yī)院）

衰老是一種自然規(guī)律，隨著時間的推移，機體常常表現(xiàn)出學習記憶能力的下降。海馬是最早被認為在學習與記憶過程中起關鍵作用的中樞結構，因此海馬神經(jīng)元細胞被廣泛作為學習記憶的模型。

MCLK1 是一種被發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲中的生物鐘基因，在線粒體代謝調節(jié)和衰老中發(fā)揮重要作用。線蟲MCLK1 突變失活〔1～3〕和小鼠MCLK1 部分失活〔4～6〕延長了這些生物的平均和最大壽命。有文獻報道稱，MCLK1 蛋白的缺失對腦缺血有一定的保護作用，對MCLK1+/-小鼠進行腦缺血再灌注后發(fā)現(xiàn)，MCLK1+/-小鼠前額葉皮層和海馬部位變性退化的神經(jīng)元數(shù)量顯著少于野生型小鼠〔7〕。本課題組前期分別選取3 月齡和15 月齡的C57BL/6-MCLK1基因敲 除小鼠（MCLK1+/-）與野生 型小鼠（MCLK1+/+），利用Morris 水迷宮測定空間認知能力后發(fā)現(xiàn)，MCLK1+/-小鼠空間學習記憶能力均較野生型小鼠增強。提示MCLK1 基因可能參與海馬神經(jīng)元細胞凋亡的調節(jié)，但具體機制尚未清楚。本實驗將進一步探究MCLK1 與海馬神經(jīng)元細胞的關系，探討MCLK1 蛋白表達減少對小鼠海馬神經(jīng)元細胞系（HT22 細胞）凋亡的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT22細胞（蘇州大學神經(jīng)精神疾病研究所贈予）；MCLK1慢病毒（購自上海吉瑪制藥技術有限公司）；DMEM/High Glucose（購自美國Hyclone 公司）；胎牛血清（購自美國Gibco 公司）；MCLK1，低氧誘導因子（HIF）-1 抗體（購自美國Proteintech 公司）；B 細胞淋巴瘤（Bcl）-2、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax），半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase）-3、酶切（cleaved）-Caspase-3，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K），蛋白激酶B（Akt），磷酸化（p）-Akt（購自美國Cell Signaling 公司）；PCR 試劑盒（購自日本TaKaRa 公司）；引物（購自上海生工生物工程有限公司）；原位末端標記（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（購自碧云天公司）。

1.2 儀器與設備 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；C1000 Touch 聚合酶鏈反應（PCR）儀和蛋白電泳儀、濕轉儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 慢病毒包裝 對數(shù)期生長的293T 細胞在15 cm 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至60%融合時，將重組慢病毒的骨架質粒與包裝質粒用RNAi-Mate 共轉染至病毒包裝細胞293T，培養(yǎng)6 h 后棄去原來培養(yǎng)液，加入新鮮的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。72 h 后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，3 600 r/min 4℃離心4 min，用0.45 μm 過濾器過濾，濾液在離心機中進行超速離心，13 000 r/min 4℃離心2 h，將濃縮液收集分裝后-80℃冰箱保存。該實驗步驟由上海吉瑪制藥技術有限公司完成。

1.3.2 慢病毒滴度檢測 293T 細胞按3×104細胞/孔的濃度接種96 孔板，混勻后于37℃5% CO2培養(yǎng)24 h；將病毒原液10 μl，用10% 胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)液10 倍稀釋3～5 個梯度；吸去96 孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入100 μl 10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，于37℃5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h；通過熒光顯微鏡計數(shù)熒光細胞，結合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。該實驗步驟由上海吉瑪制藥技術有限公司完成。

1.3.3 慢病毒轉染 將細胞以1×105/孔鋪到六孔板中，培養(yǎng)24 h 后進行轉染，實驗分為兩組，慢病毒轉染組（Lv-MCLK1 組）與陰性對照組（Lv-NC 組），每組3 個復孔。將12 μl 聚凝胺（Polybrene）加入12 ml DMEM 基礎培養(yǎng)基，每孔加入2 ml。取20 μl MCLK1 慢病毒加入70 μl DMEM 基礎培養(yǎng)基，每孔加入30 μl，共3 個復孔。取10 μl NC 加入80 μl DMEM 基礎培養(yǎng)基，每孔加入30 μl，共3 個復孔，37℃孵育24 h 后用含血清的完全培養(yǎng)基換原培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.3.4 TUNEL 染色 將兩組細胞接種于24 孔板，每孔密度大約1×105/孔，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1 次。4%多聚甲醛固定細胞30 min，用PBS 洗滌1 次；加入0.3% Triton X-100 的PBS，室溫孵育5 min，用PBS 洗滌1 次；在PBS 配制的0.3%過氧化氫溶液中室溫孵育20 min，以滅活切片內源性過氧化物酶，隨后用PBS 洗滌3 次；在樣品上加50 μl TUNEL 檢測液，37℃避光孵育60 min，用PBS 洗滌1次，滴加0.1～0.3 ml 標記反應終止液，室溫孵育10 min，用PBS 洗滌3 次；在樣品上加50 μl 辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）工作液，室溫孵育30 min，用PBS 洗滌3 次；滴加0.2～0.5 ml二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，室溫孵育15 min，用PBS 洗滌3 次；蘇木素復染15 s，PBS 洗滌3 次。光學顯微鏡下觀察。400 倍下選擇5 個具有代表性的視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)和陰性細胞數(shù)，并計算陽性細胞表達百分率，陽性表達百分率=陽性細胞數(shù)/（陽性細胞數(shù)+陰性細胞數(shù)）×100%，計算平均值。

1.3.5 Western 印跡PBS 清洗細胞后，將細胞刮下，離心沉淀，每皿加入300 μl 蛋白裂解液，冰上裂解2 h，10 000 r/min 4℃離心30 min，取上清液置新的離心管中，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量，按照1 ∶4的比例加入5×蛋白上樣緩沖液，95℃變性10 min，取30 μg 蛋白樣品，進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），100 V 濕轉90 min，將膜放入封閉液室溫緩慢搖動2 h，加入一抗4℃過夜，TBST 洗3 次，每次10 min，加入二抗，室溫輕搖2 h，TBST 洗3 次，每次10 min，用ECL 工作液化學發(fā)光?？贵w稀釋倍數(shù):鼠單克隆抗體β-actin（1 ∶10 000），兔單克隆抗體MCLK1（1 ∶200），Bax（1 ∶500），Bcl-2（1 ∶800），Caspase-3（1 ∶500），cleaved-Caspase-3（1 ∶500），PI3K（1 ∶500），Akt（1 ∶500），p-Akt（1 ∶500）。HRP 標記山羊抗鼠IgG（1 ∶10 000），HRP 標記山羊抗兔IgG（1 ∶20 000）。圖像掃描后用ImageJ 進行灰度值分析。

1.3.6 實時熒光定量PCR 將HT22 細胞接種于6孔板中，密度大約2×105/孔時，加入病毒24 h 后收集細胞，細胞沉淀中加入1 ml RNA 裂解液，200 μl氯仿，10 000 r/min，4℃離心15 min；轉移上清到新的離心管中，每管加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min，10 000 r/min，4℃離心15 min；棄掉上清，加入預冷無水乙醇清洗沉淀，10 000 r/min，4℃離心5 min；棄去上清，室溫干燥15 min，用適量RNasefree-water 溶解沉淀。經(jīng)過總RNA 提取后檢測RNA濃度，72℃，10 min；42℃，60 min，72℃，15 min 進行反轉錄得到cDNA，進行q-PCR，條件:95℃，10 min；95℃，15 s，60℃，1 min，40 ct；每個基因設3 個復孔，實驗結果采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 目的基因的引物序列

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0 軟件進行獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 TUNEL 染色結果 光鏡下觀察，TUNEL 染色及蘇木素復染后凋亡細胞核呈棕色，位于胞核，由于凋亡細胞所處的時期不同，細胞呈環(huán)形、小圓形或顆粒狀、橢圓形等不同形狀，提示凋亡細胞有典型的新月體狀、核濃縮及大量微核體的形成，正常細胞核呈藍色。與Lv-NC 組相比，Lv-MCLK1 組的HT22 細胞的陽性細胞數(shù)明顯較少〔（8.06±0.77）% vs（4.13±1.06）%，P＜0.01〕，見圖1。

圖1 TUNEL 檢測MCLK1 對HT22 細胞凋亡的影響(×400)

2.2 MCLK1 及HIF-1 的表達 Lv-MCLK1 組MCLK1 蛋白表達水平顯著低于Lv-NC 組（P＜0.01），HIF-1 表達水平明顯高于Lv-NC 組（P＜0.01），表明降低MCLK1 蛋白水平能夠促進HIF-1蛋白的表達，見圖2、表2。

圖2 轉染MCLK1 慢病毒對HT22 細胞中MCLK1、HIF-1 蛋白表達的影響

2.3 PI3K/AKT 信號通路蛋白的檢測 Lv-MCLK1組HIF-1，p-Akt 水平明顯高于Lv-NC 組（P＜0.01），而Akt 并未發(fā)生明顯變化（P＞0.05），見表2、圖3。

表2 兩組MCLK1、HIF-1、PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達變化(,n=3)

表2 兩組MCLK1、HIF-1、PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達變化(,n=3)

圖3 轉染MCLK1 慢病毒對HT22 細胞中p-Akt、Akt、PI3k 蛋白表達的影響

2.4 凋亡相關蛋白的檢測 與Lv-NC 組相比，Lv-MCLK1 組Bax 水平?jīng)]有明顯變化，Bcl-2 水平明顯升高（P＜0.01），Bax/bcl-2 比值下降（P＜0.01），Caspase-3、cleaved-Caspase-3 蛋白水平顯著降低（P＜0.01），見圖4、表3。

圖4 轉染MCLK1 慢病毒對HT22 細胞中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、Caspase-3 蛋白表達的影響

2.5 采用RT-qPCR 檢測mRNA 水平的變化 Lv-MCLK1 組中Bcl-2（P＜0.05）、Bax（P＜0.01）的mRNA 水平較Lv-NC 組升高，但是Bax/Bcl-2 的mRNA水平無明顯變化（P＞0.05），Caspase-3 的mRNA 水平明顯降低（P＜0.01），見表3。

表3 兩組Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3 蛋白及mRNA 表達(,n=3)

表3 兩組Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3 蛋白及mRNA 表達(,n=3)

3 討論

本研究利用細胞轉染技術，降低MCLK1 表達，同時進行TUNEL〔8〕，發(fā)現(xiàn)凋亡細胞有典型的新月體狀、核濃縮及大量微核體的形成，并且降低MCLK1的表達可以抑制HT22 細胞凋亡。因此猜想，MCLK1+/-小鼠學習記憶能力改善可能與MCLK1 表達不足在一定程度上減少海馬神經(jīng)元細胞的凋亡有關。

HIF-1 誘導物能增加HIF-1 及其靶基因的表達，具有抑制tau 蛋白異常磷酸化，保護神經(jīng)元的作用〔9〕。HIF-1 可能通過PI3K/Akt 通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用，并且Akt 信號通路對Bax、Bcl-2、Caspase-3的mRNA 和蛋白質表達均具有調控作用〔10〕。MCLK1 缺失時，HIF-1 蛋白表達水平升高〔11〕，本實驗結果與之前文獻報道一致。提示MCLK1 可能通過HIF-1 對神經(jīng)元凋亡產(chǎn)生一定影響。檢測PI3K/Akt 信號通路中相關蛋白后提示HT22 細胞中MCLK1 蛋白缺失后HIF-1 水平上調可能是PI3K/Akt 信號通路被激活的原因之一，激活的PI3K/Akt信號通路可能對HT22 細胞的凋亡、生存等功能產(chǎn)生一定影響。

神經(jīng)細胞凋亡受多種因素調控，凋亡因子對神經(jīng)細胞起直接調控作用，包括Bax、Bid、Bcl-2 等〔12，13〕。研究表明，腦原代皮質神經(jīng)元培養(yǎng)物中Bcl-2 過表達能夠產(chǎn)生抑制神經(jīng)元凋亡作用，Bax 為促凋亡因子，能夠拮抗Bcl-2 的抗凋亡作用，引發(fā)神經(jīng)細胞凋亡〔14〕。Caspase-3 是細胞凋亡過程中發(fā)揮重要功能的凋亡執(zhí)行蛋白之一，Caspase-3 通過酶原活化發(fā)揮各種功能，然而Caspase-3 基因表達水平在一定程度上影響著酶原的水平，近年來，越來越多證據(jù)表明，Caspase-3 基因表達水平也與多種疾病過程密切相關，如大鼠短暫性腦缺血后，下丘腦CA1 區(qū)椎體神經(jīng)元Caspase-3 的mRNA 水平隨時間上調〔15，16〕。本研究結果提示MCLK1 可能通過調節(jié)Bcl-2 及Caspase-3的表達及激活程度來影響細胞的凋亡，但對其他凋亡相關蛋白是否也有作用，需要我們更深入、全面的研究。qRT-PCR 檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3 的mRNA 水平后發(fā)現(xiàn)，病毒轉染組中Caspase-3 的mRNA 水平明顯下降，Bax，Bcl-2 基因水平同時上調，Bax/Bcl-2 無統(tǒng)計學意義，這與我們在蛋白水平觀察到的Bax 沒有明顯變化不一致，或許MCLK1 促進了Bax mRNA 轉錄，但間接通過另一途徑抑制了其蛋白表達或促進了蛋白降解，而最終出現(xiàn)mRNA 與蛋白水平不一致，其具體的機制還需要進一步研究。